展晓亮 刘 帅 祗明花 李 聪 梁红玉 佟苗苗 赵丽丽 赵 丁

小檗碱对糖尿病大鼠肠系膜血管形态改变的作用*

展晓亮 刘 帅 祗明花 李 聪 梁红玉 佟苗苗 赵丽丽 赵 丁#

目的：观察小檗碱对糖尿病大鼠肠系膜血管病变的干预作用。方法：24只SD大鼠随机分为对照组、模型组和小檗碱组，每组8只。模型组和小檗碱组腹腔注射链脲佐菌素(STZ,55mg/kg)制备糖尿病大鼠模型，对照组腹腔注射等量生理盐水。大鼠成模两周后，小檗碱组灌胃给予小檗碱(200mg/kg)，对照组和模型组灌胃等量双蒸水，三组均每日一次，连续2周，比较各组体重及血糖变化。之后处死各组大鼠，取其肠系膜、各级血管及其周围组织制备石蜡切片，HE染色，显微镜观察各组大鼠肠系膜各级血管管径及血管和周围组织的病理学变化。结果：与对照组比较，模型组大鼠实验28天后体重减轻(P<0.01)，血糖升高(P<0.01)。二、三级动静脉管径较对照组明显增大(P<0.05或P<0.01)；血管弹性膜分层不清，内膜白细胞黏附增多；血管周围脂肪组织中脂肪细胞皱缩，大量炎性细胞浸润，神经节肿胀。小檗碱组较模型组体重、血糖无明显差异(P>0.05)，但三级动脉管径和二级静脉管径较模型组明显收缩(P<0.05或P<0.01)；而且小檗碱组较模型组血管弹性膜分层清晰，内膜白细胞黏附减少；脂肪细胞形态、炎性细胞浸润及神经节形态均有一定程度的改善。结论：小檗碱对糖尿病大鼠肠系膜小血管和微血管及周围组织的病理变化有一定改善作用。

小檗碱；糖尿病；肠系膜血管；脂肪组织；大鼠

糖尿病血管病变是糖尿病最常见的并发症之一，其机制可能与血管内皮依赖性舒缩功能降低、大血管粥样硬化、微循环障碍等有关[1]。高血糖及促炎因子引起的血管内皮活性氧增加、细胞凋亡及炎症，可造成血管损伤，尤其是血管内皮细胞受损[2]，进而诱发较多糖尿病性并发症。因此糖尿病血管病变成为研究重点[3]。肠系膜具有各种管径的大、小微血管，常作为脏器血管主要是微血管药物研究的靶器官。

小檗碱是常用中药黄连的主要有效成分，不仅能直接降低血糖、血脂和胰岛素抵抗，而且对高血糖、高血脂、高胰岛素引发氧化应激增加、氧自由基产生增多引起的血管内皮细胞损伤均具有很好的改善作用[4,5]。后者的作用机制是通过抑制炎性因子、促炎因子的表达而减少炎症的发生，发挥血管保护作用[6,7]。截至目前，有关小檗碱对糖尿病大鼠肠系膜各级血管及其周围组织病变的作用未见报道。本实验在前期研究[8]的基础上观测糖尿病大鼠肠系膜不同大小动、静脉血管管径和血管组织以及周围组织的病理学改变，探讨小檗碱对糖尿病大鼠肠系膜血管及组织损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验药物和仪器

小檗碱粉剂(四川协力制药有限公司，批号：061002)；链脲佐菌素注射液(STZ，美国A-LEXIS Biochemicals公司，批号：0460041-6)；血糖仪及血糖试纸(美国雅培制药有限公司)；RM2135型石蜡切片机(德国LEICA公司)；CX31型光学显微镜(日本OLYMPUS公司)；缓冲液、双蒸水、生理盐水自配，电子天平市购。ISCapture(V3.5)成像分析软件(上海深瞳光电科技有限公司)。

1.2 实验动物和分组处理

健康清洁级SD大鼠，雄性，体重200g±20g，由河北医科大学动物实验中心提供(许可证号：SCXK(冀)2013-1-003)，适应性饲养(环境符合GB14925-2010要求)5天后，采用随机数字表法将实验动物分为对照组、模型组和小檗碱组，每组8只。模型组和小檗碱组大鼠复制糖尿病模型：用0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 4.0-4.4)将STZ配成1%溶液，按55mg/kg体重单次腹腔注射(注射前禁食12h)，对照组注射等量生理盐水。72h后尾静脉采血，用常规方法测定空腹血糖(FBG)。FBG≥16.7mmol/L为制模成功，两组各8只大鼠均成模，悉数纳入实验。2周后，小檗碱组给予200mg/kg小檗碱溶液(取适量小檗碱粉末，以双蒸水配制成50mg/ml溶液)，对照组和模型组灌胃等量双蒸水，三组均每天一次，连续2周。

1.3 观测指标和方法

1.3.1 体重和血糖(BG)：观察和测定各组大鼠实验前及药物干预两周后的毛色变化、体重和BG水平(试纸法)。

1.3.2 肠系膜血管管径测量：上述指标观测完毕，断头处死各组大鼠，立即剖腹分离肠系膜，包括从腹主动脉分支的肠系膜上动脉(A0)，动脉分支后的一级血管(伴行动、静脉A1、V1)，一级血管分支后的二级血管(伴行动、静脉A2、V2)，二级血管分支后的三级血管(伴行动、静脉A3、V3)及其周围组织，中性甲醛固定后常规脱水包埋、石蜡切片(5μm)、HE染色，透射光学显微镜观察肠系膜血管及周围组织的病理学变化。使用ISCapture成像软件多边形工具描画拟合血管内径，测量出各级血管内径周长(即周径)，表征血管管径大小。

1.3.3 肠系膜血管及其周围组织的病理学观察：在测量肠系膜管径的同时，选择三组变化较为明显的动、静脉分级血管进行组织学分析及对这些血管周围组织进行病理学观察，记录典型病变并摄取图像。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 各组大鼠体重及BG水平比较

实验前，三组大鼠的体重及BG水平差异无统计学意义(F=1.698、2.676，P>0.05)。实验28天后，三组大鼠体重及BG水平差异均有统计学意义(F=95.528、51.420，P<0.01)。与对照组比较，模型组大鼠体重显著降低(t=11.625，P<0.01)，BG水平明显升高(t= -9.448，P<0.01)，且毛色无光泽，尾部发黑；与模型组比较，小檗碱组体重有所增加，BG水平也有下降，毛色也略有改善，但差异无统计学意义(t=-1.125、1.508，P>0.05)，即仍与对照组存在明显差异(P<0.01)，见表1。

表1 各组大鼠体重和BG水平比较均=8)

注：与对照组相同时间比较，1)P<0.01

2.2 各组大鼠肠系膜各级血管管径变化

2.2.1 动脉管径：三组大鼠的A0、A1级动脉管径差异无统计学意义(F=0.291、0.806，P>0.05)。三组间A2级动脉管径差异有统计学意义(F=11.116，P<0.01)；模型组较对照组明显扩张(t=-3.728，P<0.01)，小檗碱组较模型组有所收缩，但差异无统计学意义(t=0.531，P>0.05)。三组间A3级动脉管径差异亦有统计学意义(F=15.202，P<0.01)，模型组较对照组明显扩张(t=-5.254，P<0.01)，小檗碱组较模型组管径明显收缩(t=3.717，P<0.01)，基本恢复至对照组水平(P>0.05)。见表2。

2.2.2 静脉管径：三组大鼠肠系膜V1级静脉管径差异无统计学意义(F=0.643，P>0.05)。三组间V2级静脉管径差异有统计学意义(F=9.628，P<0.01)，模型组较对照组显著扩张(t=-3.557，P<0.01)，小檗碱组较模型组明显收缩(t=2.201，P<0.05)。三组大鼠间肠系膜V3级静脉管径差异亦有统计学意义(F=29.07，P<0.01)，模型组较对照组明显扩张(t=-8.02，P<0.01)，小檗碱组与模型组差异无统计学意义(t=0.291，P>0.05)。见表3。

2.3 各组大鼠肠系膜各级血管组织病理变化

对照组大鼠肠系膜动脉的弹性膜清晰可见，内膜白细胞黏附较少；与对照组比较，模型组大鼠肠系膜动脉的弹性膜分层不清，内膜白细胞黏附增多；小檗碱组弹性膜分层较模型组清晰，内膜白细胞黏附较模型组减少。上述现象在肠系膜A3级动脉中较明显(图1)。对照组肠系膜静脉内膜白细胞黏附较少，模型组较对照组黏附明显增多，小檗碱组较模型组黏附减少。该现象在V2级静脉中较为明显(图2)。

表2 各组大鼠肠系膜各级动脉管径比较

注：n为各组各级血管采集观测支数。与对照组比较，1)P<0.01; 与模型组比较，2)P<0.01

表3 各组大鼠肠系膜各级静脉管径比较

注：n为各组各级血管采集观测支数。与对照组比较，1)P<0.01; 与模型组比较，2)P<0.05

注：对照组弹性膜分层清晰可见，血管内膜白细胞黏附较少；模型组弹性膜分层不清晰，血管内膜白细胞黏附较对照组增 多，血管扩张；小檗碱组较模型组分层清晰，血管内膜白细胞黏附减少，血管收缩

图1 各组大鼠肠系膜三级动脉(A3)的组织学变化(HE，×400)

注：对照组血管内膜白细胞黏附较少；模型组较对照组血管内膜白细胞黏附明显增多，血管扩张；小檗碱组较模型组血管 内膜白细胞黏附有所减少，血管收缩

图2 各组大鼠肠系膜二级静脉(V2)的组织学变化(HE，×400)

2.4 各组大鼠肠系膜血管周围组织病理变化

对照组血管周围脂肪组织中脂肪细胞饱满，未见明显炎性细胞浸润，神经节形态完整，微血管数量少。模型组脂肪细胞皱缩明显，几乎消失，炎性细胞大面积浸润且神经节肿胀。小檗碱组较模型组脂肪细胞饱满，炎性细胞浸润明显减少，神经节肿胀有所改善。见图3。

注：对照组脂肪细胞饱满，无炎性细胞浸润，神经节形态完整；模型组脂肪细胞皱缩，大量炎性细胞浸润，神经节肿胀； 小檗碱组较模型组的脂肪细胞形态、炎性细胞浸润及神经节形态均有所改善

图3 各组大鼠肠系膜血管及周围组织的病理学变化(HE，×400)

3 讨 论

糖尿病晚期的血管损伤不可逆，导致各种组织器官缺血缺氧性病变，造成无法挽回的后果[9]。有文献报道，小檗碱对2型糖尿病大鼠胸主动脉内皮损伤有明显的改善作用[10]。但对小血管，包括微血管的研究少见。

本实验中糖尿病大鼠肠系膜动脉弹性膜分层不清，二级、三级动、静脉血管扩张，血管壁肿胀变形，周围脂肪组织皱缩严重，神经节水肿，炎细胞浸润增多。小檗碱灌胃两周后，肠系膜三级动脉、二级静脉的炎性损伤得到修复，血管舒缩功能加强，同时炎性细胞减少，炎症改善，但一级及以上动、静脉血管舒缩能力未见增加，提示小檗碱对糖尿病小血管病变的作用明显，这种作用可能主要与其抑制机体的炎症反应密切相关[7]。对于本实验中肠系膜上动脉及一级动、静脉血管管径在三组间变化差异不明显，认为可能由于本文糖尿病模型尚处早期而未损伤到大血管。该现象表明糖尿病血管病变应是从小血管开始发生，随着病变进展可能会累及大血管。

本实验采用测量血管内径周长的方法来表征血管管径的大小，与传统的管径测量方法有所不同，传统方法针对规整圆形血管直接选取血管边缘，测量线过血管中心到达对侧边缘即为所测管径[11]，由于糖尿病模型大鼠血管变形严重，用这种方法测量会造成明显的误差，而用血管内径周长来表征管径大小则使这种误差大大减少，结果相对准确。

综上，对于糖尿病大鼠肠系膜血管及周围脂肪组织的损伤可以通过小檗碱灌胃干预，使之获得不同程度的改善和保护。但本文所用动物数和所选血管支数均较少，所得结果有待进一步增加样本量予以验证。

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本文第一作者简介：

展晓亮(1992—)，女，汉族，2012级药学专业本科生

1 刘声远. 糖尿病血管病变机制与防治进展[J].微循环学杂志, 2006, 16(4):3-6.

2 Rask-Madsen C, King GL. Mechanisms of disease: endothelial dysfunction in insulin resistance and diabetes[J]. Nat Clin Pract Endocrinol Metab, 2007, 3(1): 46-56.

3 傅重洋, 洪光祥. 血管内皮生长因子对神经系统血管再生与神经营养作用研究进展[J].国外医学·骨科学分册, 2005, 26 (5): 280-283.

4 Zhang Y, Li X, Zou D, et al. Treatment of type 2 diabetes and dyslipidemia with the natural plant alkaloid berberine[J]. Clin Endocrinol Metab, 2008, 93(7): 2 559-2 565.

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8 祁艳艳, 郝璋森, 梁红玉, 等. 小檗碱对糖尿病大鼠胃壁神经元及肠系膜和心脏微血管损伤的保护作用[J].微循环学杂志, 2015, 25(2): 5-7, 11.

9 牟佳威, 张慧娟. Chemerin在糖尿病微血管病变中的研究进展[J]. 医学综述, 2015, 21(23): 4 309-4 311.

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Effects of Berberine on Morphological Changes of Mesenteric Vessels in Diabetic Rats

ZHAN Xiao-liang, LIU Shuai, ZHI Ming-hua, LI Cong, LIANG Hong-yu, TONG Miao-miao, ZHAO Li-li, ZHAO Ding#

School of Pharmacy, Institute of Integrated Traditional and Western Medicine, Hebei Medical University, Shijiazhuang, 050017, China；#

Objective: To observe the intervention effect of berberine (BBR) on diabetic rat mesenteric vascular lesion. Method: 24 SD rats were divided into normal group, diabetic model (DM) group and BBR group randomly (n=8). Rats in DM group and BBR group were injected streptozotocin (STZ) (55mg/kg) to induce diabetic rat model, the normal group rats were injected with the same amount of saline. After two weeks of STZ injection, BBR group rats were administrated BBR (200mg/kg) by gavage, normal and DM group rats were administrated equal amount of distilled water once a day for two weeks. Compared the changes of body weight and blood glucose, and then killed all of rats and took the vascular tissues for routine treatment. Paraffin sections of vascular tissues were made. After HE staining, the circumference of vessel and histopathological changes of the mesenteric vascular at all levels and peripheral tissues were observed by microscopy. Results: In DM group rats, body weight was reduced (P<0.01), level of blood glucose was increased significantly (P<0.01), compared with the normal group after 28 days. The circumferences of the secondary and tertiary arteries (veins) were significantly increased, compared with the normal group (P<0.05,P<0.01). In DM group, the elastic membrane layer was unclear, endometrial leukocyte adhesion was increased, fat cells in perivascular adipose tissue shrinked, a large number of inflammatory cells infiltrated, and ganglion swelling. The BBR group had no significant difference in body weight and blood glucose compared with the control group (P>0.05), but the circumferences of the tertiary artery and secondary vein were decreased compared with the DM group significantly (P<0.05orP<0.01). After BBR treated, the vascular elastic membrane layer was clear, endometrial leukocyte adhesion was decreased. Adipocytes morphology, inflammatory cell infiltration and ganglion morphology was improved to a certain extent. Conclusion: BBR improves the small vessels, microvascular and surrounding tissue in mesenteric of diabetic rats morphological changes to a certain extent.

Berberine; Diabetes; Mesenteric vessels; Adipose tissue; Rat

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本文2016-11-01收到，2016-12-30修回

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A

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