袁啸天+宋彦璋+刘喆昊+张凯+杨浚哲

摘 要：血细胞作为细胞免疫的承担者，与体液免疫因子的提供者，在对虾的免疫系統中具有重要作用。本实验通过对凡纳滨对虾感染副溶血性弧菌后，总血细胞，大颗粒细胞，小颗粒细胞与透明细胞各自的数量变化与单类血细胞数占总血细胞数的比例变化，发现总血细胞数，三类血细胞数与其各自所占比例在感染的不同时期发生了不同程度的变化，大体呈现先增长后减少的数量变化，探索对虾的细胞免疫与弧菌感染力的关系，为制定高效的对虾流行病防控策略提供理论依据。

关键词：凡纳滨对虾；血细胞；大颗粒细胞；小颗粒细胞；透明细胞

DOI：10.16640/j.cnki.37-1222/t.2017.05.190

1 研究意义和目的

对虾弧菌病是对虾养殖中危害严重的疾病之一，其中鳗弧菌和副溶血弧菌广泛存在于自然海水中，具有流行广、发病率高、危害大、死亡率高等特点，造成对虾养殖业严重的经济损失。因此，进行对虾免疫学研究，为建立高效、健康的对虾养殖模式提供基础科学依据。对虾的血细胞既是细胞免疫的承担者， 又是体液免疫因子的提供者， 分为透明细胞、小颗粒细胞和大颗粒细胞三类， 各自担负着不同的免疫功能。在健康对虾体内三类血细胞的比例和数量相对稳定。当对虾患病后， 三类血细胞的比例和数量会发生相应的变化。

本课题旨在探索对虾的细胞免疫与弧菌感染力的关系，为制定高效的对虾流行病防控策略提供理论依据。

2 材料与方法

2.1 材料与试剂

健康的凡纳滨对虾（ Litopenaeus vannamei ） 购自南山市场。副溶血性弧菌（ATCC17802）购自中国菌种保藏中心。

抗凝剂（ NaCl 450mM， KCl 10mM， EDTA-Na2 10mM， HEPES 10mM， pH7.3）与血淋巴等渗。

2.2 预实验

将十组凡纳滨对虾，每组3尾，分别注射0.1ml不同浓度的副溶血弧菌，记录各组凡纳滨对虾的死亡时间。选择接近168小时全部死亡的一组的副溶血弧菌浓度进行下一步实验。如果死亡时间与理想时间相差过大，则进行多次预实验。

2.3 对虾感染试验

选取体长10cm±0.5cm，体重30g±2g，外观健康的凡纳滨对虾，暂养于180L水族箱中。一周后，感染组取30尾注射副溶血性弧菌，对照组取30尾注射等量生理盐水。两组分别饲养，每日投喂饲料一次。实验过程连续充气，水温为24℃-26℃。

2.4 血样的制备

注射弧菌后，用配有26号针头的1ml注射器从实验组3尾凡纳滨对虾与对照组3尾凡纳滨对虾的腹血窦处分别取0.4ml血淋巴。

取血前在注射器中装入0.4ml的抗凝剂（4℃），取血后将血淋巴和抗凝剂的混合物注入装有0.4ml抗凝剂的离心管中，混匀，混合液用于虾总血细胞与单类血细胞数的测量。

2.5 血细胞计数

取一滴A液加到血球计数板上在400倍显微镜下观察计数血细胞并计算虾总血细胞与单类血细胞数，此后每隔12小时重复取血并观察，直至实验组凡纳滨对虾全部死亡。

3 结果

3.1 总血细胞计数及比较结果

72小时内血细胞总数呈上升趋势，72小时后直至对虾死亡血细胞总数呈下降趋势。血细胞最多时上升到对照组凡纳滨对虾血细胞总数的232%。108小时后血样开始模糊不清，死亡的细胞数增多。

3.2 单类血细胞数计数及比较结果

大颗粒细胞：60小时内大颗粒细胞数呈上升趋势，60小时后直至对虾死亡大颗粒细胞数不断下降。未感染弧菌时，大颗粒细胞数占血细胞总数的14.91%，60小时内，其所占比例呈上升趋势，最高时达到46.74%。此后其所占比例呈下降趋势，最后一次测量时，比例下降到30.25%。

小颗粒细胞：84小时内小颗粒细胞数呈上升趋势，84小时后直至对虾死亡小颗粒细胞数不断下降。92小时至120小时时下降速度最快。

透明细胞：72小时内透明细胞数呈上升趋势，72小时后直至对虾死亡透明细胞数不断下降。未感染弧菌时透明细胞数在血细胞总数中所占比例最大为51.20%，72小时内其所占比例不断下降，72小时时最低，达到35.22%，此后有所回升，最后一次测量时，比例达到50.65%

4 总结

对虾的三类血细胞在免疫中具有不同的功能。本研究发现，在对虾感染弧菌初期，总血细胞数量和单类血细胞数量都发生了显著的升高，说明感染弧菌后三类血细胞参与了对抗弧菌的细胞免疫反应。随着感染时间的增加，对虾的血细胞数量发生显著的下降。

可以推断，对虾在抵抗弧菌的过程中，其先天免疫系统表现为先强后抑的规律。对虾抵抗副溶血性弧菌时，三类血细胞数量和比例上的变化规律的发现为制定对虾流行病防控的高效策略提供理论依据，具有重要意义。

参考文献：

[1]姜国建，于仁诚，王云峰，颜天，周名江.对虾血细胞中一氧化氮合成酶鉴定与分析方法研究[J].中国水产科学，2004（11）：177-184

[2]叶燕玲，陈宽智.中国对虾血细胞超微结构、分类及计数[J].青岛海洋大学学报，1993（23）：35-41.

[3]姜国建，于仁诚，王云峰，颜天，周名江.中国明对虾血细胞中一氧化氮合成酶的鉴定及其在白斑综合症病毒感染过程中的变化[J].海洋与湖沼，2004（35）：346-352.

指导老师：姜国建，白晓歌