邓咏梅，李园，张金山，刘少颜(广州医科大学附属第三医院，广州510150)

·基础研究·

局部125I粒子植入联合丹皮酚灌胃对裸鼠肺癌移植瘤的治疗观察

邓咏梅，李园，张金山，刘少颜
(广州医科大学附属第三医院，广州510150)

目的 观察局部125I粒子植入治疗联合丹皮酚灌胃对A549裸鼠肺癌移植瘤的抑瘤效果，并探讨其可能作用机制。方法 Balb/c裸鼠52只，均制作A549裸鼠肺癌移植瘤模型，随机分成A、B、C、D组，每组13只。A组采用丹皮酚150 mg/kg灌胃治疗，1次/d,共治疗14 d；B组采用直视下经皮穿刺125I(0.4 mci/粒)放射性粒子植入术治疗；C组先行125I粒子植入联合治疗，后采用150 mg/kg丹皮酚灌胃, 1次/d,共治疗14 d；D组为“冷粒子”(表观活度为0)植入对照。 治疗14 d时处死各组裸鼠，称取瘤重(g)，计算肿瘤体积、肿瘤抑制率。观察各组肿瘤组织细胞凋亡情况，检测各组肿瘤细胞水通道蛋白5(AQP5)、生存素(Survivin)蛋白。结果 治疗14 d时A、B、C组瘤重均低于D组(P均<0.05)，A、B、C组肿瘤体积均小于D组(P均<0.05)；A、B、C组抑瘤率分别为35.6%、57.3%、74.4%，组间两两比较，P均<0.05。A、B、C、D组细胞凋亡指数分别为20.15%±3.07%、46.00%±12.00%、67.30%±9.80%、9.49%±1.52%，组间两两比较，P均<0.05。A、B、C、D组AQP5蛋白的阳性表达率分别为30.1%±8.5%、27.3%±5.4%、33.9%±7.6%、28.4%±6.1%，B、D组比较，P<0.05。A、B、C、D组Survivin蛋白的阳性表达率分别为18.0%±7.0% 、16.0%±5.0% 、9.5%±2.4%、43.0%±11.0%, 组间两两比较，P均<0.05。结论 局部125I粒子植入联合丹皮酚灌胃对A549裸鼠肺癌移植瘤的的抑瘤效果较好，其机制可能与其上调肿瘤组织AQP5蛋白表达、下调Survivin表达，促进肿瘤细胞凋亡。

肺癌；肺肿瘤；丹皮酚；125I粒子植入治疗；水通道蛋白5；生存素

肺癌是目前我国恶性肿瘤致死的主要原因。放疗是目前临床常用的肺癌局部治疗方法，其适用范围广，但部分肺癌患者特别是非小细胞肺癌患者的放射敏感性较低，治疗过程中可产生放射抗拒，导致放疗效果不佳[1]。125I粒子植入治疗是一种新兴的内照射放射治疗方法，其可提高肿瘤患者的肿瘤局部控制率[2]，已被用于用于肺癌、胃癌等多种实体瘤及术后残存肿瘤的治疗中。丹皮酚是牡丹、芍药根皮中的活性成分,既往研究发现其对人乳腺癌细胞EMT6、食管癌细胞Eca-109、人结肠癌LoVo细胞等多种肿瘤有明显的抑制作用[3～5]，是一种新的多靶点抗癌剂。最新研究[6，7]认为,丹皮酚与化疗药物或放疗药物联用可起到协同抗肿瘤作用。但目前关于关丹皮酚与125I粒子植入治疗肺癌的相关报道较少。本研究观察了局部125I粒子植入治疗联合丹皮酚灌胃对A549裸鼠肺癌移植瘤的抑瘤效果，并探讨其可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 A549裸鼠肺癌移植瘤模型制作及分组 取7～10周的Balb/c裸鼠52只，雌雄不限，体质量17.5～21.3 g，动物合格证号为44007200025334。由广东省实验动物中心制作A549裸鼠肺癌移植瘤模型5，肿瘤长径7～8 mm，平均7.1 mm。将52只裸鼠随机分成A、B、C、D组，每组13只，常规饲养后备用。

1.2 各组125I粒子局部植入与丹皮酚干预方法 A组采用丹皮酚(购自广州晶晶生物科技有限公司，纯度99.3%)150 mg/kg灌胃治疗，1次/d,共治疗14 d；B组采用直视下经皮穿刺125I(0.4 mci/粒)放射性粒子植入术治疗：125I放射性粒子由天津赛德医药科技有限公司提供，单粒籽源表观活度为14.8 MBq。固定裸鼠后显露瘤体，消毒瘤体及周围皮肤，选择瘤体中央部位为进针点，将125I粒子置于5 mL针尖上，穿刺针(芯)穿刺后将125I粒子推入瘤体中，退出穿刺针，轻压穿刺部位。将裸鼠放回饲养笼内。每个肿瘤植入1颗125I粒子；C组先行直视下经皮穿刺125I粒子植入术，后采用150 mg/kg丹皮酚灌胃治疗, 1次/d,共治疗14 d；D组为“冷粒子”(表观活度为0)植入对照。

1.3 各组裸鼠瘤重、肿瘤体积和抑瘤率、合并用药效应测算 治疗第14 天处死各组裸鼠，完整剥出肿瘤组织并称重(g)，测量肿瘤的三维径长(a、b、c,cm)，按公式V=a×b×c/6 计算肿瘤体积(V,cm3)，根据肿瘤瘤重计算肿瘤抑制率。肿瘤抑制率=(对照组平均瘤重-干预组平均瘤重)/ 对照组平均瘤重×100%。根据Webb分数乘积法测算C组的合并用药效应。(fa)1,2=1-[1-(fa)1][1-(fa)2]。(fa)1和(fa)2分别为药物的瘤质量抑制率，(fa)1，2为理论相加效应，如果合并用药效应大于理论相加效应，则表示有协同作用，如果合并用药效应等于理论相加效应，则表示有相加作用。

1.4 各组肿瘤组织细胞凋亡情况观察 采用TUNEL法观察各组肿瘤组织细胞凋亡情况。TUNEL试剂盒购自德国罗氏公司，所有操作均严格按照试剂说明书进行。在高倍视野下随机选择5个视野，每个视野计数100个细胞，观察细胞凋亡情况，镜下细胞核、细胞质内浓染致密的块状荧光为阳性细胞，否则为阴性细胞，计算各组细胞凋亡指数(AI)。AI=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

1.5 各组肿瘤组织AQP5、Survivin蛋白检测 采用免疫组化染色法检测各组细胞AQP5、Survivin蛋白。AQP5兔单克隆抗体试剂(批号EPR3747)为美国abacm公司产品，一抗兔抗Survivin多克隆抗体试剂为美国Thermo Fisher Scientific Inc 产品。所有操作均严格按照使用说明书进行。AQP5、Survivin蛋白表达情况见图1。Survivin阳性表达为胞质和或细胞核呈棕黄色或棕褐色着染, AQP5阳性表达为细胞膜或细胞质呈棕黄色，细胞核不着色。计算AQP5、Survivin阳性表达率(阳性细胞数/总细胞数×100%)。

注：左为Survivin阳性表达；右为AQP5阳性表达。

图1 AQP5、Survivin蛋白表达情况

2 结果

2.1 各组裸鼠瘤重、肿瘤体积和抑瘤率比较 治疗14 d时各组裸鼠瘤重、肿瘤体积和抑瘤率比较见表1。C组合并用药理论效应为72.5%，而实际抑瘤率为74.4%。

表1 治疗14 d时各组裸鼠瘤重、肿瘤体积和抑瘤率比较±s)

注：与D组比较，*P<0.05；与A组比较，#P<0.05；与B组比较，&P<0.05。

2.2 各组肿瘤组织AI比较 A、B、C、D组AI分别为20.15%±3.07%、46.00%±12.00%、67.30%±9.80%、9.49%±1.52%，组间两两比较，P均<0.05。各组细胞凋亡情况见图2。

图2 各组细胞凋亡情况

2.3 各组肿瘤组织AQP5、Survivin蛋白阳性表达率比较 A、B、C、D组AQP5蛋白阳性表达率分别为30.1%±8.5%、27.3%±5.4%、33.9%±7.6%、28.4%±6.1%，B、D组比较，P<0.05；A、C组AQP5蛋白阳性表达率高于D组，但P>0.05。A、B、C、D组Survivin蛋白阳性表达率分别为18.0%±7.0% 、16.0%±5.0% 、9.5%±2.4%、43.0%±11.0%, 组间两两比较，P均<0.05。

3 讨论

125I粒子植入治疗被认为是一种具有高度适形的放疗，可长时间、缓慢持续低剂量照射肿瘤本身，利用射线的电离辐射作用使肿瘤细胞产生辐射损伤，进而抑制肿瘤细胞的增殖、促进细胞凋亡。但其存在剂量分布不均匀且依赖放射源的几何空间排布的特点，可能导致治疗靶区热点或冷点的出现，影响对肿瘤的控制。电离辐射损伤是放射治疗的基础,辐射损伤作用的关键靶点是细胞核内的DNA。中药丹皮酚是牡丹、芍药根皮中的活性成分,其药理活性十分广泛，对多种肿瘤有明显的抑制作用，其抗肿瘤的分子机制之一是下调COX-2的表达，抑制Bcl-2基因、Survivin的表达，诱导细胞凋亡[4，6]。丹皮酚与化疗药物或外照射放射线联用，起协同抗肿瘤作用[6,7]，何峰等[7]研究发现,本研究结果发现，采用丹皮酚灌胃、125I粒子植入内照射及联合治疗均能抑制A549肺腺癌的生长，且联合用药的抑瘤率高达74.4%，明显高于丹皮酚、125I粒子单独应用时的抑瘤率，提示丹皮酚联合125I粒子植入治疗对A549肺癌有协同抗肿瘤的作用。促进细胞凋亡是125I粒子植入治疗和丹皮酚灌胃抑制肿瘤生长的重要机制，本研究中，D组肿瘤细胞结构清晰可见，形状、大小各异，细胞核大而浓染；A、B、C组肿瘤组织镜下可见肿瘤细胞数量减少，紧贴125I粒子周边可见大片红染坏死区，肿瘤组织坏死明显，部分肿瘤细胞核出现核仁边界不清、核破碎、核固缩。且A、B、C组AI高于D组，提示丹皮酚联合125I粒子植入治疗可促进肿瘤细胞的凋亡。

AQP5主要位于呼吸道上皮表层的柱状上皮细胞顶膜和黏膜下腺腺泡细胞顶膜，是一种高度选择性的水通道蛋白，其主要作用是参与水的转运，维持细胞内外水平衡，并参与调节肺脏黏液、唾液分泌及眼泪的产生[8]。因此猜测：上调肿瘤细胞AQP5表达、开放水通道将致肿瘤细胞内水含量增加，可望产生更多的氢氧自由基(OH·)，将形成更多DNA双链断裂，增加了间接辐射损伤，从而提高肿瘤细胞的放射敏感性，可见AQP5的表达将对肿瘤细胞的放射敏感性产生重要的影响[9]，AQP5有可能是一种新型的辐射敏感标志物和内源性辐射增敏剂，丹皮酚对人A549肺腺癌肿瘤组织AQP5的表达上调不明显，原因可能为丹皮酚能够上调AQP5的表达，因为在治疗早期AQP5变化尚不明显或丹皮酚对AQP5的表达呈剂量依赖性，此次实验的剂量没达到阈值，或确实对AQP5的表达没有调节作用，这些都有待于做大样本实验来进一步探索。

放射增敏剂能提高肿瘤细胞对射线的敏感性，从而增强射线对肿瘤细胞的杀伤力。文献[10]报道，肿瘤细胞Survivin的表达与肿瘤细胞的放射敏感性有关，头颈部、结直肠恶性肿瘤细胞对放射的抗拒与Survivin高表达有关。本研究发现，与D组比较，各治疗组的Survivin蛋白的表达均降低，C组的Survivin蛋白表达率降至9.5%±2.4%，与A、B组比较，差异有统计学意义，提示丹皮酚与125I粒子植入治疗联用可明显下调Survivin蛋白表达，提高肿瘤细胞对射线的敏感性，天然药物丹皮酚可作为放射增敏剂用于肿瘤放疗中。

综上所述，125I粒子植入治疗联合丹皮酚对A549肺癌裸鼠的的抑瘤效果较好，两者联合应用可克服单一内照射治疗的不足且产生协同抗肿瘤的作用，可提高治疗疗效，其机制与下调Survivin表达、提高肿瘤细胞对射线的敏感性及促进细胞凋亡有关。但肿瘤的增殖受诸多因素的调控，且丹皮酚联合125I粒子植入治疗的具体作用机制尚需通过时间依赖性、剂量依赖性实验等进一步研究来证实。

[1] Das AK,Bell MH,Nirodi CS, et al. Radiogenomicspredicting tumor responses to radiotherapy in lung cancer[J]. Semin Radiat Oncol， 2010,20(3):149-155.

[2] 胡丽丽，李小东，张雪宁，等. 影像引导下125I粒子植入治疗肺癌的疗效分析[J].国际放射医学核医学杂志，2013,37(4):203-206.

[3] 王建杰，闫冬梅，董航，等.丹皮酚抑制小鼠乳腺癌细胞生长作用及机制的研究[J].中国免疫学杂志，2013,29(1)：48-51.

[4] 吴珊，权循凤，孙国平，等. 丹皮酚对食管鳞癌细胞株Eca-109的体外放射增敏作用和机制[J].安徽医科大学学报，2014,49(10)：1418-1422.

[5] 李明，谭诗云.丹皮酚对结肠癌细胞系LoVo细胞增殖、凋亡的影响及机制[J].中国医药导报，2014,11(7):23-27.

[6] 雷宇，金问森，陈先平，等. 丹皮酚对人肺腺癌A549细胞放射增敏作用机制的研究[J].中华放射医学与防护杂志,2012,32(2):166-169.

[7] 何峰，李劲东，王志明.丹皮酚联合5-氟尿嘧啶对裸鼠人肝癌移植瘤的抑制作用和机制[J].肿瘤防治研究，2011,38(5):505-508.

[8] Verkman AS. Aquaporins in Clinical Medicine [J]. Annu Rev Med, 2012,63(1):303-316.

[9] Chae YK, Woo J, Kim MJ, et al. Expression of aquaporin5(AQP5) promotes tumor invasion in human non small cell lung cancer [J]. PLoS One，2008,3(5):e2162.

[10] 庄喜兵,乔田奎,许国雄,等.放射抗拒Lewis肺癌细胞系的建立[J].中华放射医学与防护杂志,2015,35(11):805-808.

广东省中医药局建设中医药强省科研课题基金资助项目(20151277)。

张金山(E-mail: zhangjinshangd137@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.07.009

R734.2

A

1002-266X(2017)07-0031-03

2016-08-30)