陈雷雷，陈晓波，洪郭驹，何伟

(1.广州中医药大学第一附属医院关节骨科，广州 510405；2. 广州中医药大学国家重点学科中医骨伤科学实验室，广州 510405；3. 广州中医药大学第一临床医学院，广州 510405；4. 西澳大利亚大学病理与实验医学系，澳大利亚珀斯 6009)

联合高分辨率MRI和micro-CT评价桃红四物汤对兔股骨头坏死的修复作用

陈雷雷1,2#，陈晓波2,3#，洪郭驹2,3,4，何伟1,2*

(1.广州中医药大学第一附属医院关节骨科，广州 510405；2. 广州中医药大学国家重点学科中医骨伤科学实验室，广州 510405；3. 广州中医药大学第一临床医学院，广州 510405；4. 西澳大利亚大学病理与实验医学系，澳大利亚珀斯 6009)

目的 建立激素性股骨头坏死(SIONFH)家兔模型，联合高分辨率MRI和micro-CT评价桃红四物汤(THSWD)对于SIONFH微观骨性结构破坏的修复作用。方法 将25只新西兰兔随机分为3组：正常组5只、模型组和中药组(桃红四物汤组)各10只，采用内毒素(LPS)联合甲强龙(MPS)的方法制备激素性股骨头坏死模型，中药组给予0.3 g/kg桃红四物汤混悬液灌胃，正常组和模型组灌服等体积超纯水。实验第8周分别进行股骨头部3.0 T高分辨率磁共振影像仪高分辨率MRI检查，对股骨头部苏木精-伊红染色病理检测及microCT检测。结果 1)高分辨率MRI中模型组股骨头内可见低信号带；中药组股骨头外形趋于正常，股骨头内近骨骺处有小块低密度区，大部分骨组织灰度值正常。模型组和正常组相比，结构参数前者ROE值增加，ROE/NR比例增加，中药组与模型组相比，ROE值减少，ROE/NR比例减少，差异有显著性(P<0.05)。2)经苏木精-伊红染色中，模型组可见部分骨小梁断裂，骨细胞核固缩，骨小梁空骨陷窝，骨髓细胞坏死，差异有显著性(P<0.05)，中药组可见成骨活动仍较为活跃，骨小梁形态较好。3)在micro-CT中，模型组与正常组相比，前者BV/TV、Conn.D.、SMI、Tb.N、Tb.Th、值降低，BS/BV、Tb.Sp增高。中药组中，BS/BV、Tb.Sp显著低于模型组，Conn.D.、SMI、Tb.N增高，差异有显著性(P<0.05)，ROI三维重建可见模型组骨小梁紊乱，可见普遍断裂，骨质较少；中药组相对而言骨质改善，骨小梁有局部性修复。结论 桃红四物汤能促进兔SIONFH模型的微观骨性结构修复和生物力学环境改善。

股骨头坏死；高分辨率MRI；Micro-CT；桃红四物汤；骨小梁；兔

激素性股骨头坏死(steriod-induced osteonecrosis of femoral head, SIONFH)是好发于中青年人群的骨科难治疾病，也是股骨头坏死最常见类型。由于激素类药物在临床的广泛应用，并发SIONFH的病例也日益增多[1]。SIONFH一经激素诱导发生，则坏死局部的修复反应随之启动。主要体现为骨小梁数量减少变薄或断裂，致局部应力集中，促使坏死区皮质骨骨折[2]；在MRI上表现为局灶性低信号带、双线征、水肿高信号区域及囊变低信号区，源于结构性改变所带来的非感染性炎症反应[3]；在临床上，微观病理反应可导致股骨头塌陷发生，造成髋关节生物力学的不稳定，导致髋关节半脱位以及股骨头软骨的破坏。如何通过有效的措施延缓和改善头内坏死组织的破坏和塌陷，是目前SIONFH非手术治疗的研究重点。

桃红四物汤(Taohong Siwu decoction，THSWD)出自《医宗金鉴》，主要由桃仁、红花、生地、当归、赤芍、川芎等六味中药组成，具有活血祛瘀的功效。中医认为，“血瘀证”是SIONFH的关键病机，而临床实践表明以桃红四物汤为代表方的“活血祛瘀法”广泛应用于SIONFH治疗当中，且疗效确切。因此，采用中药“活血祛瘀法”治疗或能起到修复力学失衡，改善骨微环境，从而延缓股骨头塌陷。鉴于此，本文建立新西兰兔SIONFH动物模型，采用高分辨率MRI和MicroCT检验等方法，观察桃红四物汤对SIONFH股骨头修复的骨微结构影响，活血祛瘀法促进SIONFH修复的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

普通级新西兰兔，雌雄各半，共25只，24 周龄，体重3～3.5 kg，来源于广东省医学实验动物中心[SCXK(粤)2014-0035]。标准兔粮适应性饲养，自由饮水，室温(23±2)℃，明暗周期12 h/12 h，定期消毒及通风。于2015年1月～10月在广州中医药大学动物实验中心及重点学科中医骨伤科学实验室完成。

1.1.2 仪器及试剂

检测仪器TP1020自动脱水机、Autos全自动染色机(德国Leica公司)；BX53显微镜(Olympus公司)；3.0T高分辨率磁共振影像仪(GE Health Care公司)。CT100柜式锥形束微型CT(Scanco公司)。

1.1.3 药物

桃红四物汤药物按《医宗金鉴》组成：桃仁10 g、红花5 g、生地12 g、当归12 g、赤芍10 g、川芎10 g, 购自广州中医药大学第一附属医院。

1.2 方法

1.2.1 分组及造模方法

设计随机对照动物实验，新西兰兔25只，随机分为3组，即正常组、模型组和中药组，模型组和中药组每组10只，正常组5只。激素性股骨头坏死的造模方法参照Qin等[4]的方法，LPS 10 μg/kg 耳缘静脉注射1次，24 h后臀部肌肉注射MPS 40 mg/kg，隔间24 h连续注射6次。正常组注射等体积生理盐水。注射激素期间，每天每只动物相应臀肌处注射青霉素10 万单位，连续6次，预防感染。

1.2.2 中药制备与干预方法

桃红四物汤药物置于专用中药壶制备成混悬液，按照人的临床等效剂量换算，兔的临床等效剂量为0.3 g/kg。最后一次注射MPS 24 h后，中药组给予桃红四物汤混悬液灌胃，正常组和模型组灌服等体积超纯水，连续8周。

1.2.3 高分辨率MRI

由广州中医药大学第一附属医院影像科提供3.0T高分辨率磁共振影像仪。扫描序列包括轴位T2WI、轴位T2WI压脂及冠状位T1WI序列。其中，轴位T2WI序列：TR/TE=4100 ms/85 ms，层厚/层间距为2 mm/0.2 mm，FOV为180 mm×180 mm，矩阵为320×224。轴位T2WI压脂序列：TR/TE=367 ms/76.8 ms，层厚/层间距为2 mm/0.2 mm，FOV为170 mm×170 mm，矩阵为320×224。冠状位T1WI序列：TR/TE=4134 ms/85 ms，层厚/层间距为2 mm/0.2 mm，FOV为180 mm×180 mm，矩阵为320×224。

1.2.4 Micro CT扫描

由Scanco公司提供CT100柜式锥形束微型CT。X线(5 m焦点直径，30-90 kVp/20-50 keV(160A)；探测器为3072400；分辨率为1.25 m, 4 m；图像矩阵：512512至81928192。扫描尺寸为100140 mm(Xl)。

1.2.5 指标测定

(1)光镜观察

截取股骨头，剔除周围肌肉及韧带组织，沿正中冠状面剖开，用4%中性甲醛溶液(pH 7.4)固定48 h，再置于10%EDTA-Tris缓冲液中脱钙，隔天更换脱钙液，直至完全脱钙以后，流水冲洗，逐级乙醇脱水，二甲苯透明处理2 h，石蜡包埋、切片，切片厚度为4 μm，常规HE染色。光镜下观察骨髓腔内骨髓细胞、骨小梁及骨细胞形态及空骨陷窝等。

(2)高分辨率磁共振检查

麻醉前禁食12 h，戊巴比妥30 mg/kg耳缘静脉注射进行麻醉，静脉注射必须缓慢，同时观察肌肉的紧张度、角膜反射和对皮肤疼痛的反应。麻醉中采取保温措施，保持气道通畅和组织的营养，进行双侧髋关节的MRI扫描。MRI扫描在广州中医药大学第一附属医院进行，生成的图像文件保存为DICOM格式，通过移动硬盘拷贝至计算机工作站。MRI检查完成后将新西兰兔运送回动物房，苏醒后常规饲养。MRI资料经由Image J进行阈值分析，包括冠状位坏死水肿区 (region of osteonecrosis and edema, ROE)、正常区 (normal region, NR)、ROE/NR比值。

(3)Micro-CT检测

将所有纳入研究的家兔模型耳缘静脉空气注射处死，延双侧臀肌外侧切开，暴露双侧股骨头，用动物实验用咬骨嵌取下股骨头及转子部。给予4%多聚甲醛固定2周。将股骨纵轴与显微CT 检查床滑轨的移动轴平行近端进行显微CT 扫描。对显微CT扫描的结果用标准体模校准后，手动选取股骨头区域建立三维兴趣区(region of interest，ROI)，兴趣区为完整股骨头区域。检测参数包括组织体积(tissue volume，TV)、骨体积(bone volume BV)；直接测量和三角测量法(triangulation, TRI)模式下的连接密度(connectivity density, Conn.D.)、结构模型指数(structure model index, SMI)、骨小梁数量(trabecular number, Tb.N)、骨小梁厚度(trabecular thickness, Tb.Th)、骨小梁分离度(trabecular separation/spacing, Tb.Sp)，并进行三维重建。

1.3 统计学处理分析

2 结果

2.1 造模过程事件分析

20只新西兰兔用于建立SIONFH模型，其中有1只在注射内毒素后24 h死亡，19只存活，存活率为95%。模型组有9只出现坏死征象，坏死发生率为90%(9/10)；中药组没有出现坏死征象，坏死发生率为0%。

2.2 股骨头坏死模型评价

20只新西兰兔用于建立激素性股骨头坏死模型，股骨头坏死造模成功的标准参照Ikemura等[5]的评价方法：模型组：骨小梁稀疏变细，结构紊乱，出现骨髓细胞碎片，骨小梁空骨陷窝或骨小梁内骨细胞核固缩，伴随着周围骨髓细胞的坏死，细胞数目及网状结构较正常稀疏，脂肪细胞体积增大，有的融合成泡状。正常组：骨小梁完整，排列规则，骨小梁中的骨细胞清晰可见，空骨陷窝少见，骨髓中造血细胞丰富，脂肪细胞相对较少，形态正常。如图1所示，A为正常组股骨头的病理切片征象。B为模型组出现股骨头坏死的病理征象，可见部分骨小梁断裂，骨细胞核固缩，骨小梁空骨陷窝，骨髓细胞坏死。C为中药组股骨头病理征象，可见成骨活动较为活跃，骨小梁形态较好。正常组空骨陷窝率为(8.96±1.43)%，模型组为(26±1.25)%，两组比较差异有显著性(P<0.05)。

2.3 高分辨率磁共振扫描

人体股骨头坏死MRI表现为，负重区软骨下出现局灶性信号改变，低信号带、双线征、水肿高信号区域及囊变低信号区。家兔模型较人体为不典型，可依据其信号变化进行判断(图2)。各组MRI扫描如图2所示，正常组股骨头外形为半圆形，灰度信号均匀；模型组股骨头外形基本正常，股骨头内可见低信号带，提示为股骨头坏死区；中药组股骨头外形正常，股骨头内近骨骺处有小片状低信号区，大部分骨组织灰度值正常，提示股骨头坏死修复较好。结构参数分析结果表明，模型组和正常组相比，前者ROE值增加，ROE/NR比例增加，中药组与模型组相比，ROE值减少，ROE/NR比例减少，差异有显著性(P<0.05)，提示活血祛瘀法可缓解坏死区域水肿(表1)。

2.4 MicroCT检测

MicroCT检测发现，模型组与正常组相比，前者BV、Conn.D.、SMI、Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp、DA值降低，BV/TV比例下降。中药组与模型组相比，前者BV、Conn.D.、SMI、Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp、DA值升高，BV/TV比例增加，差异有显著性(P<0.05)，ROI三维重建可见模型组骨小梁紊乱，可见普遍断裂，骨质较少；中药组相对而言骨质改善，骨小梁有局部性修复，说明活血祛瘀法促进兔激素性股骨头坏死的骨小梁修复和微观骨性结构改善(表2)。

表1 各组股骨头低信号带参数的比较±s)

注: 与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01; 与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。(下表同)

Note. Compared with the normal group，*P<0.05，**P<0.01; compared with the model group，#P<0.05，##P<0.01.(The same in the following tables).

表2 各组股骨头ROI结构参数的比较±s)

注：A.正常组；B.模型组；C.中药组。(下图同)图1 造模后不同组新西兰兔股骨头HE染色图像特点(×200)Note.A. Normal rabbit; B. Model rabibit; C. Treated rabbit(The same in the following figures).Fig.1 Histological changes of femoral head in the rabbits

图2 激素型新西兰兔股骨头高分辨率MRI图像Fig.2 High resolution magnetic resonance imaging of the rabbit femoral head.

图3 各组家兔模型micro-CT三维结构重建图Fig.3 3D-reconstruction pictures of Micro-CT images of the rabbit femoral heads

3 讨论

SIONFH生物力学机制复杂，直接导致了药物治疗的力学修复效果评估的困难。在发病过程中，坏死区的骨吸收-形成偶联失效引起骨小梁等骨微结构的变化，使载荷失衡，传导及分散作用失效。同时，坏死区骨微结构破坏导致了局灶性无菌炎症、水肿反应，是促成破坏和修复的作用发生的关键因素。因此，量化评估坏死区的骨微结构及环境是评价SIONFH靶向药物的重要依据。“血瘀证”是中医学理解SIONFH的发病机理[6,7]。以桃红四物汤为代表方的活血祛瘀法是治疗SIONFH的基本法则[8]。实验研究采用桃红四物汤含药血清干预坏死骨微粒刺激的巨噬细胞发现，含药血清能增高TGF-β1、抑制TNF-α的表达，进而促进激素性股骨头坏死骨修复[9,10]，但其修复生物力学的性能仍有待验证。骨微结构的改变能直接影响骨的生物力学性能。松质骨的力学性能不仅依赖骨的数量而且依赖它的结构。因此，通过获得的骨微结构参数结合力学检测能更合理地评价骨质疏松及抗骨质疏松疗效效果。因此，本文将从需要深入研究该法在SIONFH的生物学作用，以进一步阐明其促进SIONFH修复的作用机制。

目前，客观量化骨微结构的改变首选Micro-CT技术。Micro-CT具有全面、立体、无创测量骨微结构，评价骨质量及预测骨强度的新兴技术[11,12]。该项技术于1989年[12]首次应用于骨组织的微结构研究，此后逐渐发展为计算空间分辨率的效应及建立骨小梁结构参数的图像处理技术[14]。研究提示，Micro-CT可成功运用于人股骨头坏死标本的空间结构评估。如彭江等[15]采用相关三维参数对骨坏死样本的空间结构进行评估，其结果表明：硬化区的BV/TV明显增加，Tb.Th明显增厚，Tb.Sp变窄，SMI与正常区域的骨小梁无差别；而塌陷区的BV/TV明显减少，Tb.Th明显变薄，Tb.N和Tb.Sp增加，SMI呈现杆状模型。也有学者将Micro-CT结果与有限元分析结合，极大的提高了坏死区力学性能评估精度和质量[16]。在评价软组织病理反应上首选的磁共振成像，具有活体检测、软组织敏感等特点。许多学者认为骨髓水肿是由于病灶周围骨小梁微骨折导致股骨头内部生物力学发生异常。机械应力可能在骨髓水肿形成过程中起重要作用，骨髓水肿代表股骨头塌陷和应力改变后的继发表现[17,18]。由于动物模型标本的特殊性，能真正检测坏死区局部水肿信号的技术要求很高。如何运用具有高分辨率、特殊动物项圈进行磁共振成像是SIONFH动物模型MRI诊断的关键突破点。本文所阐述的课题项目基于动物研究的最新技术，尝试通过联合高分辨率MRI和Micro-CT 技术扫描家兔模型的股骨头，将系统解决普通磁共振未能识别动物水肿信号及临床用CT对于精确测量骨小梁结构参数的短板，达到量化坏死组织标准的目的。

研究结果表明，桃红四物汤干预下的活体股骨头坏死区T1序列中，水肿征象从大片状低信号到股骨头内近骨骺处有小片状低信号区，其余骨组织灰度值正常。另外，经ImageJ对低信号带灰度阈值识别并测量出其面积ROE，结果提示ROE/NR于中药干预后比值下降，与观察所得结论复合，提示桃红四物汤可促进水肿吸收及坏死修复。从离体的Micro-CT结果看，中药组骨体积与组织体积之比(BV/TV)较模型组无统计学差异，而骨表面积与组织表面积之比(BS/TS)降低，提示桃红四物汤可促使坏死区骨组织的再生和修复，骨小梁密度增加；从具体的骨微结构看，骨小梁数量(Tb.N)在中药组中增加，骨小梁分离度(Tb.Sp)减少，局部骨小梁空隙形成降低，提示桃红四物汤可使骨微结构状态改善；结构模型指数(SMI)及连接密度(Conn.D.)升高，提示桃红四物汤可使骨微结构联系紧密，促进结构稳态；经二维图像重建三维模型后可发现，中药组模型的骨量均明显比模型组降低，但BV/TV却升高，提示桃红四物汤促进坏死组织进入修复期，使出现局部硬化，骨密度增高，但总体骨量减少，即佐证了临床坏死后易于趋向塌陷的现象。

综上所述，联合高分辨率MRI和Micro-CT检测可获得骨微结构参数，合理地评价SIONFH及桃红四物汤疗效效果。本实验的生物力学结果表明，坏死区骨微结构及组织环境的改变能直接影响生物力学性能，而桃红四物汤的“祛瘀”作用能较好的改善坏死局部的生物力学环境。

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Effect of Taohong Siwu Decoction on the repair of steroid-induced osteonecrosis of femoral head in rabbit models evaluated by high-resolution MRI combined with Micro-CT

CHEN Lei-lei1,2#, CHEN Xiao-bo2,3#, HONG Guo-ju2,3,4, HE Wei1,2*

(1. Department of Orthopedics, the First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, China; 2. the National Key Discipline and the Orthopedic Laboratory of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405; 3. the First Medical College of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405; 4.Faculty of Pathology and Laboratory Medicine, the University of Western Australia, Australia 6009)

Objective To establish a rabbit model of steroid-induced femoral head and explore the effect of Taohong Siwu Decoction (THSWD), a traditional Chinese medicine prescription, on the repair of bone microstructure assessed by high-resolution MRI combinaed with Micro-CT. Methods 25 healthy 24-week old New Zealand rabbits (male∶female=1∶1) were divided into three groups: 5 in the control group, 10 in the model group and 10 in theTHSWD treatment group. We establish the rabbit model with intramuscular injection of endotoxin (LPS) and methylprednisolone (MPS). The treatment group was given 0.3g/kg of THSWD for 8 weeks. The control group and model group were administred with equal volume water for 8 weeks. Then all the femoral heads of rabbits were taken and examined with high-resolution MRI, histopathology and Micro-CT. Results 1) The MRI of the femoral heads of model group revealed a wide range of lower density areas in high resolution MRI,that of the treatment group showed a relatively normal shape of the femoral head with small low density areas. Comparing the treatment group with model group, the values of ROE and ROE/NR were significantly decreased in the THSWD treatment group (P<0.05). 2) The pathological examination showed fracture of bone trabeculae, karyopyknosis, empty lacunae, necrosis of bone marrow cells in the model group (P<0.05). Empty lacunae rate in the model group was much higher in the model group than the normal one (P<0.05). In the THSWD treatment group, bone formation was active and a better trabecular morphology was observed. 3) The micro-CT imaging showed that compared the model group with control group, the values of BV/TV, Conn.D., SMI, Tb.N and Tb.Th in the model group were decreased, while BS/BV and Tb.Sp were increased. The values of BS/BV and Tb.Sp values in the treatment group were significantly lower, while Conn.D., SMI, and Tb.N were increased than that of the model group (P<0.05 for all). Conclusions The results of this study show that Taohong Siwu Decoction can promote the healing of steroid-osteonecrosis of femoral head, the repair of bone microstructure, and improve the biomechanics in the femoral head.

Osteonecrosis, femoral head; High-resolution MRI; Micro-CT; Taohong Siwu decoction;Trabeculae, bone; Rabbit

HE Wei, E-mail: hewei1123@21cn.com

国家自然科学基金资助项目(81302990)；广东省杰出青年科学基金(2015A030306037)；广东省高等学校学科与专业建设专项资金项目(2013LYM 0010)。

陈雷雷(1982-)，男，临床医学博士，主治医师，专业：股骨头坏死的基础与临床研究。E-mail: yutian_1010@sina.com；陈晓波(1987-)，男，在读临床医学博士，专业：股骨头坏死的基础与临床研究。E-mail: 404185214@qq.com共同第一作者

何伟(1958-)，男，博士生导师，主任医师，教授，专业：股骨头坏死的基础与临床研究。E-mail: hewei1123@21cn.com。

Q95-33

A

1005-4847(2017) 01-0025-06

10.3969/j.issn.1005-4847.2017.01.005

2016-07-26