陈含冰，张雨晴，刘津尧，刘领弟，聂 磊，韩 梅

(河北医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室，河北 石家庄 050017)

·论 著·

载脂蛋白C1表达与血管内膜增生关系的初步研究

陈含冰，张雨晴，刘津尧，刘领弟，聂 磊，韩 梅*

(河北医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室，河北 石家庄 050017)

目的探讨载脂蛋白(apolipoprotein, APO)C1表达与血管重塑的关系。方法利用颈总动脉结扎术制备血管内膜增生模型，采用HE染色检测内膜增生情况，采用Western blot检测血管组织APOC1与SM22α蛋白表达水平，采用组织免疫荧光检测APOC1在血管壁的分布。结果随着结扎时间的延长，新生内膜明显增厚，小鼠颈总动脉结扎术后不同时间点，血管新生内膜中SM22α表达量逐渐降低，APOC1表达量逐渐升高，两者变化趋势相反。免疫荧光染色亦显示，在增厚的内膜区，APOC1荧光强度增强，与内膜厚度呈正相关。结论APOC1表达上调可能参与平滑肌细胞表型转化和血管重塑过程。

血管内膜；载脂蛋白C类；肌，平滑

载脂蛋白C1是肝脏中表达的一种蛋白质，是构成血浆脂蛋白的主要蛋白质成分，参与脂质在血浆中的转运。近来越来越多的研究表明，APOC1在糖尿病和动脉粥样硬化中亦都扮演重要角色[1-3]。SM22α作为血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)早期的分化标志物之一，不仅在细胞骨架组建和平滑肌细胞表型转化过程中发挥重要作用[4]，而且还参与调节血管平滑肌细胞的氧化应激、炎症、迁移和增殖[5-8]，对稳定血管内环境具有重要意义。SM22α表达异常与动脉粥样硬化有着密切的关系，是VSMC表型转化和血管重塑的一种重要标志物[7-9]。我室用转录组学测序技术研究证实，SM22α基因敲除小鼠的血管炎性基因表达增强，其中APOC1是明显上调的基因之一，发生动脉粥样硬化的易感性增大[10]。血管内膜增生是动脉粥样硬化斑块形成的一种常见病理表现，在此过程中，APOC1表达变化以及与SM22α的关系鲜有报道，本研究以此入手，利用颈总动脉结扎法制备血管内膜增生小鼠模型，以SM22α表达变化作为生物标志，探究APOC1与新生内膜形成和血管重塑之间的关系。

1 材料与方法

1.1 试剂和动物

1.1.1 实验动物 野生型C57BL/6小鼠及专用标准鼠粮由河北省实验动物中心提供，取8～12周龄小鼠建模。所有动物实验均按照河北省实验动物中心动物管理条例进行。

1.1.2 主要试剂 SM α-actin抗体购自Epitomics公司(cat.no.1184-1)，APOC1抗体购自BBI公司(cat.no.AB21657b)，异氟烷购自鲁南贝特制药公司，PMSF购自Sigma公司，TritonX-100购自MP Biomedicals公司，其他化学试剂均为进口或国产分析纯。

1.1.3 主要仪器 小动物麻醉机(Matrx公司)，正置显微镜(Leica公司)，倒置荧光显微镜(OLYMPUS公司)，FRESCO 17低温离心机(Thermo公司)，冰冻切片机(Leica公司)，Odyssey红外荧光成像系统(LICOR公司)，RC26Plus低温离心机(SORVALL公司)，Centrifuge 5415D离心机(Eppendorf公司)，酶标仪(Thermo公司)，超低温冰箱(三洋公司)，水平摇床(Thermo公司)，制冰机(三洋公司)，高压蒸汽灭菌锅(三洋公司)。

1.2 实验方法 ①小鼠颈总动脉结扎模型制备动物手术全程于小动物麻醉机下进行，异氟烷吸入式麻醉。小鼠颈部常规备皮消毒，使用眼科剪于颈部正中作一约1 cm左右切口，体式显微镜下寻找左侧颈总动脉，小心分离迷走神经，于左侧颈总动脉分叉处近心端结扎。缝合切口。分别于结扎前和结扎后7、14、21和28 d取结扎处血管，用于后续实验。②血管组织冰冻切片与HE染色取术后不同时间点小鼠经乙醚吸入麻醉后，分离血管，剥离周围结缔组织，迅速用OCT冰冻切片包埋剂包埋，随后转移至液氮中快速冷冻。将包埋好的样品放至已预冷的冰冻切片机冷冻室内(-25 ℃)，固定于样品托上，切成5 μm厚的切片，置于-80 ℃低温冰箱保存。取出低温冻存的切片，用预冷的丙酮溶液固定5 min后水洗4 min，苏木精染核1～2 min后水洗3次，每次3 min。然后将切片放入1%盐酸乙醇溶液中3～5 s，之后水洗4 min。用伊红染液染色3～5 s后水洗3次，每次3 min，之后用70%乙醇，80%乙醇，90%乙醇，95%及无水乙醇梯度脱水。再用二甲苯透明后封片。用正置显微镜观察并拍照。③免疫荧光染色分析将冰冻切片置于预冷的丙酮溶液固定5 min后用TBS缓冲液洗次，每次5 min。而后用5%标准山羊血清封闭30 min，加入抗APOC1抗体(1∶100)于4 ℃湿盒中过夜。TBS缓冲液洗涤后加入荧光二抗(1∶50)湿盒中避光30 min。再用TBS缓冲液洗涤，1∶20 000 DAPI 染核。TBS缓冲液洗涤后80 %甘油封片。用荧光显微镜观察并拍照。④细胞总蛋白提取与Western blot分析将血管组织用裂解液充分匀浆后离心收集上清，用改良的Lowry法进行蛋白定量。取等量蛋白样品加入5×SDS上样缓冲液于100 ℃沸水浴加热5 min使蛋白变性。冷却后，用微量加样器上样于10 %凝胶加样孔内。90 V稳压电泳约30 min，待溴酚蓝进入分离胶后，换用120 V稳压电泳，至溴酚蓝前缘移动到凝胶底部，取出凝胶。用25 V恒压进行半干转转膜20～30 min。取出聚偏氟乙烯膜用含5 %脱脂奶粉的TTBS封闭液37℃封闭2 h后用一抗4 ℃封闭过夜。用TTBS溶液洗膜3×5 min后，二抗避光封闭1 h，再用TTBS溶液洗膜3×5 min后Odyssey红外荧光成像系统直接扫描成像。

1.3 统计学方法 应用SPSS 21.0统计软件分析数据，计量资料比较分别采用单因素方差分析和SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 颈总动脉结扎诱导内膜增生 HE染色结果显示，小鼠颈总动脉结扎术后7 d时，血管内膜粗糙，可见不规则增生，内膜细胞形态不一，血管中膜血管平滑肌(vascular smooth muscle cell,VSMC)排列紊乱。随结扎时间延长，增生内膜逐渐增厚，管腔逐渐狭窄(图1)。

图1 小鼠颈总动脉结扎术后不同时间点，血管内膜增生情况(HE染色×400)

2.2 SM22α和APDC1表达 小鼠颈总动脉结扎术后不同时间点，血管新生内膜中SM22α表达量逐渐降低，结扎各组均低于结扎前，结扎时间越长表达量越低，差异有统计学意义(P<0.05)。APOC1表达与SM22α的表达相反，Western blot分析以及组织免疫荧光染色结果均显示，小鼠颈总动脉结扎术后不同时间点，APOC1表达量随结扎时间延长逐渐升高，各结扎组均高于结扎前，结扎时间越长，表达量越高，差异有统计学意义(P<0.05)；但结扎7 d组与结扎14 d组差异无统计学意义(P>0.05)。见表1，图2。

免疫荧光染色亦显示，在增厚的内膜区，APOC1荧光强度增强，与内膜厚度呈正相关(图3A，3B)。结果提示APOC1可能与VSMC增殖具有因果关系。

表1 SM22α及APOC1表达比较Table 1 Comparison of protein expression of SM22α，APOC1

*P<0.05与结扎前比较 #P<0.05与结扎7 d比较 △P<0.05与结扎14 d比较 ☆P<0.05与结扎21 d(SNK-q检验)

图2 小鼠颈总动脉结扎术后不同时间，SM22α表达量逐渐降低

图3 小鼠颈总动脉结扎术后不同时间，APOC1表达量逐渐升高

3 讨 论

APOC1在肝脏、肺、肾脏、脑组织、脾脏、皮肤、脂肪组织、中央神经系统等各种器官和组织中均有表达，并且在脂质代谢中扮演多种角色[11]，APOC1还参与了多种疾病的发生和发展。Ko等[12]发现，APOC1在晚期肺癌中高表达，并认为APOC1将能作为肺癌新的诊断和预后的生物标记。蛋白质组学和基因组分析表明APOC1和腹主动脉瘤(abdominal aortic aneurysm，AAA)具有相关性，APOC1可能是AAA一种新型的生物标志物[13]。另有研究表明APOC1基因多态性与晚发性阿尔茨海默症患者的认知功能障碍有关[14-16]。APOC1是胆固醇酯转移蛋白(cholesteryl ester transfer protein，CETP)的主要血浆抑制剂，主要抑制脂蛋白结合到LDL和VLDL受体上。有研究表明，在“磷脂流出”过程中有19项途径都与APOC1的升高相关，而“磷脂流出”与动脉粥样硬化进程有着密切关系[10-11,17-18]。此外，另有研究显示，人类APOC1转基因小鼠的肝脏和皮肤胆固醇含量升高、血清三酰甘油和游离脂肪酸的水平增加[19]，APOC1可能有助于动脉粥样硬化的发生[20]。SM22α是血管平滑肌细胞表型转化的敏感标志物，血管内膜损伤局部释放的炎性因子和细胞因子等可诱导中膜平滑肌细胞去分化转变成合成型并获得增殖和迁移能力，而在合成型的平滑肌细胞中低表达或不表达SM22α。

本研究利用颈总动脉结扎术建立小鼠血管内膜增生模型，观察到SM22α的表达活性随着新生内膜形成而逐渐减少，其变化趋势与APOC1的表达呈负相关。由于实验重复次数较少，样本量不足等原因导致APOC1在结扎7 d与结扎14 d的差异无统计学意义，后续我们将进一步加大样本量以减小实验误差。根据SM22α表达水平的变化可以判断血管重构过程，是衡量血管稳态与血管重构进程的客观指标，具有对外界刺激敏感、变化幅度大、易检出的特点，其参与调节多种细胞功能和刺激应答，既是细胞骨架相关蛋白，又是多种信号途径的调节分子，鉴于其在血管稳态与血管疾病中的功能，研究者们已将其作为研究血管生物学和血管病理机制的良好靶分子。关于SM22α表达降低与APOC1表达升高之间是否具有因果关联，以及在内膜增生中的意义和作用机制仍有待进一步研究。

[1] Bouillet B,Gautier T,Aho LS,et al. Plasma apolipoprotein C1 concentration is associated with plasma triglyceride concentration,but not visceral fat,in patients with type 2 diabetes[J]. Diabetes Metab,2016[Epub ahead of print].

[2] Chung SK,Yu H,Park AY,et al. Genetic loci associated with changes in lipid levels leading to constitution-based discrepancy in Koreans[J]. BMC Complement Altern Med,2014,14：230.

[3] Bouillet B,Gautier T,Blache D,et al. Glycation of apolipoprotein C1 impairs its CETP inhibitory property:pathophysiological relevance in patients with type 1 and type 2 diabetes[J]. Diabetes Care,2014,37(4):1148-1156.

[4] Adam PJ,Regan CP,Hautmann MB,et al. Positive- and negative-acting Kruppel-like transcription factors bind a transforming growth factor beta control element required for expression of the smooth muscle cell differentiation marker SM22alpha in vivo[J]. J Biol Chem,2000,275(48):37798-37806.

[5] Dong LH,Wen JK,Liu G,et al. Blockade of the Ras-extracellular signal-regulated kinase 1/2 pathway is involved in smooth muscle 22 alpha-mediated suppression of vascular smooth muscle cell proliferation and neointima hyperplasia[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol,2010,30(4):683-691.

[6] Lv P,Miao SB,Shu YN,et al. Phosphorylation of smooth muscle 22alpha facilitates angiotensin Ⅱ-induced ROS production via activation of the PKCdelta-P47phox axis through release of PKCdelta and actin dynamics and is associated with hypertrophy and hyperplasia of vascular smooth muscle cells in vitro and in vivo[J]. Circ Res,2012,111(6):697-707.

[7] Shen J,Yang M,Ju D,et al. Disruption of SM22 promotes inflammation after artery injury via nuclear factor kappaB activation[J]. Circ Res,2010,106(8):1351-1362.

[8] 高亚坤,林燕玲,段志莉,等.一种繁育Sm22α基因敲除纯合子小鼠的方法[J].河北医科大学学报,2015,36(11):1356-1358.

[9] Shen J,Yang M,Jiang H,et al. Arterial injury promotes medial chondrogenesis in Sm22 knockout mice[J]. Cardiovasc Res,2011,90(1):28-37.

[10] Chen R,Zhang F,Song L,et al. Transcriptome profiling reveals that the SM22alpha-regulated molecular pathways contribute to vascular pathology[J]. J Mol Cell Cardiol,2014,72:263-272.

[11] Shachter NS. Apolipoproteins C-Ⅰ and C-Ⅲ as important modulators of lipoprotein metabolism[J].Curr Opin Lipidol,2001,12(3):297-304.

[12] Ko HL,Wang YS,Fong WL,et al. Apolipoprotein C1 (APOC1) as a novel diagnostic and prognostic biomarker for lung cancer:a marker phase Ⅰ trial[J]. Thorac Cancer,2014,5(6):500-508.

[13] Moxon JV,Liu D,Moran CS,et al. Proteomic and genomic analyses suggest the association of apolipoprotein C1 with abdominal aortic aneurysm[J]. Proteomics Clin Appl,2014,8(9/10):762-772.

[14] Basak JM,Verghese PB,Yoon H,et al. Low-density lipoprotein receptor represents an apolipoprotein E-independent pathway of Abeta uptake and degradation by astrocytes[J]. J Biol Chem,2012,287(17):13959-13971.

[15] Li H,Wetten S,Li L,et al. Candidate single-nucleotide polymorphisms from a genomewide association study of Alzheimer disease[J]. Arch Neurol,2008,65(1):45-53.

[16] Zhou Q,Peng D,Yuan X,et al. APOE and APOC1 gene polymorphisms are associated with cognitive impairment progression in Chinese patients with late-onset Alzheimer's disease[J]. Neural Regen Res,2014,9(6):653-660.

[17] Diez D,Wheelock AM,Goto S,et al. The use of network analyses for elucidating mechanisms in cardiovascular disease[J]. Mol Biosyst,2010,6(2):289-304.

[18] Dumont L,Gautier T,de Barros JP,et al. Molecular mechanism of the blockade of plasma cholesteryl ester transfer protein by its physiological inhibitor apolipoprotein CI[J]. J Biol Chem,2005,280(45):38108-38116.

[19] Nagelkerken L,Verzaal P,Lagerweij T,et al. Development of atopic dermatitis in mice transgenic for human apolipoprotein C1[J]. J Invest Dermatol,2008,128(5):1165-1172.

[20] Chang CT,Liao HY,Chang CM,et al. Oxidized ApoC1 on MALDI-TOF and glycated-ApoA1 band on gradient gel as potential diagnostic tools for atherosclerotic vascular disease[J]. Clin Chim Acta,2013,420:69-75.

(本文编辑：刘斯静)

The preliminary study on correlation between APOC1 and vascular neointimal formation

CHEN Han-bing， ZHANG Yu-qing， LIU Jin-yao， LIU Ling-di， NIE Lei， HAN Mei*

(DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,CollegeofBasicMedicine,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China)

Objective To discuss the correlation of apolipoprotein (APO) C1 expression and neointimal formation. Methods The intimal hyperplasia model of the mice was prepared by the common carotid artery ligation. HE staining was used to test the neointima. Western blot was used to detect the protein expression of APOC1 and SM22α, Immunofluorescence was used to detect the protein expression and distribution of APOC1. Results With the extension of time of ligation,the intimal hyperplasia was observed in the carotid arteries of mice after the ligation. At different time points of the common carotid artery ligation. the expression of SM22α was decreased in neointimal region. The expression of APOC1 was gradually increased, which was contrary to that of SM22. Immunofluorescence staining also showed that the fluorescence intensity of APOC1 was enhanced in the area of thickened intima, and it is positively correlated with the thickness of intima. Conclusion The expression of APOC1 may be involved in vascular smooth muscle cell switching and vascular remodeling.

tunica intima; apolipoproteins C; muscle, smooth

2016-05-18；

2016-06-16

国家自然科学基金课题(91439114，31271222)

陈含冰(1994-)，女，河北衡水人，河北医科大学基础医学院2012级临床医学专业本科生。

*通讯作者。E-mail:hanmei@hebmu.edu.cn

R341

A

1007-3205(2017)02-0125-04

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.02.001