詹林盛

·专家述评·

输血及细胞治疗的可视化评价技术研究*

詹林盛

输血 细胞治疗 可视化检测

输血医学已正式成为我国临床医学二级学科，对输血医学科研能力和水平提出了更高的要求，输血医学科研工作已成为输血医学学科发展的内在动力。近年来我国输血科研工作取得了显著的成绩，但与其他学科相比，还有一定的差距。如何培育输血医学新的增长点是广大输血医学科研工作者需要思考的问题。当今生命科学研究从以免疫学、分子生物学为主导的经典科学向前沿学科、高新技术相交叉融合的方向拓展，可视医学、大数据、云计算等已开始应用于生命科学研究领域，也将加速推进输血医学科学研究取得新进展。

近年来新型纳米生物技术取得快速发展，在病原诊断、药物递送、成像示踪等方面显示出良好的应用前景。而多模式分子影像技术集成光学成像（BLI）、电子计算机断层扫描（CT）、核磁共振（MRI）等互为补充，适用于对输血感染及输血免疫反应进行可视化监测，并可对活体内过继性免疫细胞跨组织器官迁移以及分子细胞组织器官整体多层次的功能信息进行表征，兼具实时、动态、无创的特点，获取结果客观准确，解析度高、分辨率高，可为输血医学临床转化提供科学性强的理论依据。

1 血液病原安全快速可视化检测技术研究 随着核酸筛查技术（NAT）的推广应用，平时常规血液病原感染安全性得到极大的提升，但在突发事件以及野战条件下，会集中出现大量伤员，需血量大、时间紧迫，往往需要临时征集血液，也需要对献血者进行血液病原体快速筛查，此时血液安全性问题依然面临挑战。因此，发展简便、快速且具有高灵敏度和高选择性的血液可视化检测方法具有以下重要意义：①实现了新型荧光纳米材料的可控合成、性质表征、生物学修饰，完成了基于金纳米棒状材料的免疫传感器的构建：该免疫传感器对乙肝表面抗原标准物质具有高灵敏度，由于采用的物理修饰模式较好地提高了免疫探针的环境适应性，使其能在多种复杂的生理介质中检测血液传染病标志物[1]；②建立了切刻内切酶介导、分子信标介导的等温扩增技术，优化了扩增条件，目前两种等温扩增方法对于细菌质粒的检测下限均达到皮摩尔量级；并构建了核酸层析检测技术平台，可对核酸扩增结果进行快速可视化判读，已开展了血小板中多种污染菌基因组的检测[2]；③建立了基于金纳米棒团聚性质的快速核酸传感器，优化了检测模式；该核酸探针对合成目的序列显示了良好的特异性、较高的灵敏度和较宽的动态范围[3]。

2 输血传染病感染及炎症的分子成像研究 由于缺乏合适的研究体系，目前整体水平上对输血相关病原（HBV/HCV）感染和宿主免疫系统的反应，在同一时间和空间的连续动态变化还缺乏深入了解，将病毒感染与免疫系统的反应作为一个真正的系统进行可视化研究还面临着挑战，因而阻碍了对输血相关病原感染、复制及其免疫逃逸、免疫清除机制等本质问题的深入研究。针对此问题，应充分发挥生物发光和化学荧光等多模式光学成像技术的优势，在模型动物水平同时针对病毒基因组和宿主免疫系统两个方面，构建多靶点、多功能分子探针（报告基因），进行病毒、宿主天然免疫信号分子以及免疫细胞等多个靶点的实时动态识别与示踪，实现病原与宿主免疫系统相互作用的多模式分子成像。在此基础上开展基于分子影像的抗感染药物筛选和疫苗评价，以及输血相关肝炎病毒致病机制研究。该研究有望进一步从整体层面上阐明输血相关肝炎病毒免疫逃逸或免疫清除的分子机制，为输血相关感染的防治研究提供基础平台。

2.1 输血相关肝炎病毒基因组标记示踪：建立了小动物尾静脉和眼底静脉丛水动力基因肝脏快速转染技术[4]，以荧光素酶（Luc）为报告基因标记HBV/HCV基因组，基于水动力转染技术和噬菌体整合酶体系，建立了系列报告基因标记的可视化HBV/HCV功能基因组小鼠体内表达体系[5-9]：包括HBV启动子调控荧光素酶表达小鼠模型，报告基因标记的HBV全基因组表达小鼠模型，HCV IRES介导Luc表达小鼠模型、HCV核心蛋白-Luc融合表达小鼠模型、报告基因标记的HCV全基因组小鼠体内长期表达模型，以及基于荧光素酶重组与互补原理建立HCV NS3/4A蛋白酶细胞和小鼠体内检测体系等，结合小动物活体荧光成像技术，实时、动态监测HBV/HCV功能基因在小鼠体内的表达。进而基于该模型体系开展病毒性肝炎慢性化进程和致肝细胞损伤过程中的作用机制研究，以及抗病毒药物和疫苗的体内可视化筛选和评价，有助于促进献血者隐匿性肝炎病毒感染及输血相关病毒性肝炎的防治研究。

2.2 输血相关病原感染引起机体炎症信号分子变化的可视化研究：针对机体炎症信号分子以及天然免疫关键信号分子，构建以Fluc为报告基因表达载体，建立输血相关病原感染引发的系列肝脏炎症信号分子在模型动物体内实时可视化监测的新方法[10-13]。包括一种基于荧光素酶定量分析肝炎病毒与宿主蛋白质相互作用的新方法及其应用；病毒感染引发肝脏细胞凋亡的实时动态监测技术；病原感染及肝脏再生过程中肝脏NF-κB活体成像监测技术；以及病毒逃逸机体免疫监视过程中发挥关键作用的IFN-β可视化示踪成像技术等。基于上述炎症及天然免疫信号分子可视化监测体系，阐明部分输血相关病原感染及致病的免疫学机制，为抗病毒免疫治疗临床前评价提供基础平台。

3 输血免疫反应的分子成像研究 除常见的溶血反应、感染、非特异性发热反应等，储存红细胞和储存血小板输注的不良反应及其机制成为目前输血安全研究的热点。在储存过程中红细胞代谢、形态结构、生理功能和生化指标等方面均发生不同程度的改变，这些系列变化称为红细胞“储存损伤”，与严重感染、多器官功能障碍、心血管事件发生、输血相关急性肺损伤、死亡率增加等不良反应密切相关。因此，加强输血相关免疫反应的发病机制及防治措施研究，是当前输血不良反应防治研究中的重要命题。通过构建系列可视化感染与炎症小动物模型，结合分子影像技术，探讨储存红细胞、血小板输注引发输血不良免疫反应的效应及其作用机制[14，15]，已开展如下研究：①分子成像监测输注储存血液诱发机体炎症反应：建立了系列细菌感染的可视化模型，以及炎症分子（SAA、TNF-α、IL-6等）可视化小动物模型，比较新鲜血液和保存时间较长的血液输注对战创伤预后的影响，阐明了储存RBCs输注对细菌感染诱导肝损伤的部分作用机制。②分子成像监测输血相关急性肺损伤：建立报告基因标记的肺脏炎症信号分子（IL-6、NF-κB、TNF-α等）转基因小鼠模型，通过“二次打击”诱发输血相关急性肺损伤，结合活体分子影像学，阐述TRALI发生后的机体氧化应激、炎症因子随时间和空间的连续动态变化，及其与肺组织炎症反应的相关性，有助于推测疾病转归及预后情况。③分子成像监测输血相关GVHD：输血相关GVHD发生的一个重要因素就是供者免疫效应细胞发生过度活化和急剧分裂增殖；通过对供者免疫细胞的荧光标记，利用多模式成像实时动态监测供者免疫效应细胞呈现的时间和空间上的程序性迁移、聚集和活化与GVHD发生的关系，为深入阐明输血相关GVHD的发生机制及防治措施的研究提供模型基础。

4 细胞治疗的体内成像示踪研究 由于技术限制，目前有关肿瘤细胞治疗研究更多关注于疗效的观察，而对于外源输注的细胞是否有效归巢于病灶或目标脏器和淋巴器官，以及是否可实现与其所调控下游细胞共定位，这其中又有哪些趋化因子或细胞因子参与了过继性输注细胞的迁移和归巢过程等，这些问题目前还没有明确的答案，特别是对于过继性输注细胞和被调控细胞亚群在同一时间和空间的连续动态变化还缺乏深入了解。本研究结合化学荧光和生物发光等多种分子影像学技术，分别对肿瘤细胞和过继性输注的免疫细胞进行荧光探针或报告基因标记，在临床前小动物水平，开展了肿瘤体内增殖转移及过继性细胞体内迁移示踪研究。结果显示体外纳米材料等修饰或预处理的免疫细胞或干细胞在体内的迁移分布规律发生明显的变化，机制主要是通过调控免疫细胞表面趋化因子受体的表达水平和细胞骨架的组织结构等，促进其向特定组织迁移和归巢能力，进而影响抗肿瘤或抗感染的作用效果[16，17]。本研究建立的小动物活体光学成像技术平台，成像反应灵敏、操作简单、数据精确，可广泛应用于生命科学研究多个领域，特别是通过对输注细胞的在体三维立体成像动态示踪观察，可以在了解其分布特征的基础上，合理运用分子生物学或某些化学药物对过继性输注细胞的迁移模式进行定向诱导和干涉，进而使其发挥功能最大化。

总之，通过开发多元化的纳米和荧光分子探针，建立基于新型纳米材料的病原检测技术；结合小动物活体影像技术，发展时空分辨、高通量、高灵敏度的成像示踪技术平台，建立输血相关传染病感染及炎症的分子成像监测体系，实时示踪输血免疫反应的过程，绘制血细胞（红细胞、血小板）及免疫细胞在体内迁移、分布、归巢聚集图谱，揭示输血影响细胞治疗效应的作用机制，输血及细胞治疗的可视化评价技术平台可以为新型输血治疗及过继性免疫细胞治疗的开发和临床转化提供参考和相关技术服务。

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R457.1

A

1671-2587（2017）06-0537-03

10.3969/j.issn.1671-2587.2017.06.001

*本课题受国家自然科学基金（No.81371806，30972615）资助

100850 北京，军事医学科学院野战输血研究所

詹林盛（1971–），男，研究员，博士，主要从事输血免疫及细胞治疗研究，（E-mail）lszhan91@yahoo.com。

2017-09-27）

（本文编辑：王虹）