张葆鑫，王兴国，郝廷

内蒙古医科大学第二附属医院创伤一科，内蒙古呼和浩特 010000

骨折的愈合、骨量的均衡和生长斗鱼力学作用有关系。在对应力作用下，成骨细胞将发挥出主要的效应。传统的医学理论认为，骨的生长来自于骨髓中的营养。右归饮是助阳补肾的基本方，起到促进骨形成的作用[1]。而骨细胞分化成熟的标志是碱性磷酸酶（ALP)的表达，骨细胞功能状态的良好和骨细胞的分化程度，都可以通过ALP的活性表达来进行反映[2]。该文通过实验对牵张应力环境下，采用右归饮含药血清促进成骨细胞分化增殖的状况加以论证。

1 材料与方法

①主要仪器包括倒置显微镜和显微拍摄系统、台式自动平衡离心机、二氧化碳恒温培养箱、电子天平以及细胞牵拉装置等。主要试剂为胎牛血清、胰蛋白酶、胶原酶等，碱性磷酸酶活性测定试剂盒、6孔平板细胞培养板均产自美国。②选用的SD大鼠均为雄性，用于血清植被，新生SD大鼠乳鼠为24 h，用于成骨细胞培养。③首先进行血清的制备，右归饮主要成分为：山茱萸、山药、枸杞、甘草、杜仲、肉桂、制附子。其次制备无药和含药血清。按照右归饮组和生理盐水组进行大鼠的分组，每组20只。右归饮组按照人的日用临床剂量进行折算，每日灌药量为20 g/kg，生理盐水组给予生理盐水的灌药量等同于右归饮组。两组均进行连续灌胃1周。末次灌胃后2 h，采用常规麻醉心脏取血的方法，将血清分离出来，在-20℃进行保存。骨细胞的培养采用序列酶消化法，将细胞进行等量分组，共分为6组，每组6孔。其次采用10%的水合氯醛腹腔注射液进行麻醉和心脏取血后，采用3 000 r/min进行10 min的离心，取得上层的血清，进行混合均匀后，除菌滤膜，分成4 mL每瓶加以分装。④对新生24 h的大鼠乳鼠，在颈椎脱臼处死后，使用75%的乙醇进行10 min的浸泡，揭去头顶的皮肤，切下头盖骨，清除骨膜、血管，放置在PBS液内进行两次的清洗，至发白后剪成小片，尺寸为1 mm×1 mm。然后放置在胰蛋白酶溶液中。清除纤维组织，再移入胶原酶溶液中，最终收集振荡后的分离细胞。⑤对于分离好的细胞进行无血清培养和同步化培养，分别进行无血清和无血清牵张形变、生理盐水血清和生理盐水血清牵张形变的培养基，设置温度为37℃。培养时间为24 h。对于各组别均施加牵张应力频率为0.5 Hz,形变量牵张应力条件为常规培养。采用ALP定量测定的方法，公式如下：

对于各组细胞进行CAKP(碱性磷酸酶染色）的处理，经过苏木素或者甲基绿进行复染液的复染，3 min后在显微镜下进行观察。

2 结果

经过12、24 h的无血清培养基和生理盐水血清对照组的对比，采用右归饮血清进行的骨细胞ALP细胞监测结果与生理盐水组的比较差异有统计学意义（P＜0.05）。无血清对照组和无血清12%牵张形变组的比较差异有统计学意义P＜0.05）。生理盐水血清12%形变组和含药12%形变组比较差异有统计学意义。

表1 各组12 h、24 h成骨细胞ALP活性测定结果（±s）

表1 各组12 h、24 h成骨细胞ALP活性测定结果（±s）

组别1 2 h A L P 2 4 h A L P无血清对照组生理盐水血清对照组右归饮血清对照组1 2%牵张无血清组1 2%牵张生理盐水血清组1 2%牵张右归饮血清组1 0 1.9 5±1 2.3 5 5 5 0.9 5±1.3 5 7 8 7.9 5±1.3 5 8 1.9 5±1.3 5 7 1 1.9 5±4 5.3 5 9 1 3.9 5±1.4 5 9 1.9 5±4.3 5 6 6 8.9 5±1.3 5 9 1 1.9 5±1.3 5 7 9.9 5±1.3 5 9 5 4.9 5±7 1.3 5 1 0 1 1.9 5±3 2.3 5

3 讨论

经过对细胞施加应力刺激之后，发现对于成骨细胞进行力学作用的影响是值得研究的[3]。低频率的牵张应力刺激能够对骨细胞的增值变化进行促进。12%的牵张形变的应力刺激比6%的牵张形变要大。在试验中设置了力学加载条件为0.5 Hz，12%的牵张形变量，在此基础上进行其他各组的骨细胞状态的观察，结果显示，右归饮含药血清的培养细胞，在进行牵拉24 h无血清培养基培养后，ALP分泌量比12 h无血清不施加牵拉培养细胞的分泌量要弱。说明，动物体内细胞感应应力刺激的先决条件，与牵张应力有很大的关系。经过试验，右归饮能够促进激素型股骨头坏死患者受抑制的骨髓间充质细胞火花，并且分化为成骨细胞，形成矿化结节[4]。机械应力刺激包括了骨压缩、骨组织改建等。右归饮作用于牵张应力刺激结合起来，需要对成骨细胞增殖分化活性状态的有效指标进行评价，而采用ALP定量分析和碱性磷酸酶染色的方法，是进行成骨细胞在药物和物理刺激下产生影响的常用方法，证明右归饮作用和牵张应力刺激，能够明显促进骨细胞ALP分泌和CAKP颗粒形成，对今后的科研和临床研究具有参考作用。

[1]汤小康,应航,倪哲吉,等.右归饮对模拟人体内应力环境中成骨细胞碱性磷酸酶分泌的影响[J].北京中医药大学学报,2013,36(8):542-545,549,后插2.

[2]陆超锋,汤小康,程婉,等.模拟人体内应力环境下对比六味地黄汤和右归饮对成骨细胞增殖分化影响的实验研究[C]//2013中国(杭州)中医药多学科研究国际学术会议论文集.2013:280-285.

[3]黄朋涛,刘景岩,王遵来,等.右归饮影响SAMP6鼠血清骨重建调控因子的实验研究[J].世界中西医结合杂志,2014,9(9):931-933.

[4]夏臣杰,尹利明,黄杰烽,等.右归饮促异体骨髓细胞向成骨分化防治辐照后骨量丢失机制的实验研究[J].山西中医学院学报,2015(4):19-21,24.