薛健　王欢

摘 要：本研究采用紫外线诱变育种的方法，筛选并选育纳豆激酶高产菌株。试验结果表明，使用20W紫外灯照射90s，经过筛选及纤维蛋白平板检测，获得了一株产酶活为498.84U/mL的高产菌株，产酶活力较出发菌株提高了6.78%。

关键词：纳豆激酶；物理诱变；紫外线

中图分类号：S33 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20161131002

纳豆是一种日本传统食品，具有助消化、预防心血管疾病、延缓衰老等功效。1987年日本学者须见洋行首次对纳豆及其提取物作了系统研究[1]。纳豆激酶是在纳豆发酵过程由纳豆生产菌产生的一种具有纤溶活性的丝氨酸蛋白酶[2]，具有很强的溶解纤维蛋白和血浆酶底物活性，它不但能作用于纤维蛋白，而且还能激活动物体内纤溶酶原，从而增加内源性纤溶酶的量与功能，表现出较强的溶血栓作用，可用于治疗和预防血栓病 [3]。获得纳豆激酶的主要途径是利用可以代谢产生纳豆激酶的菌株发酵获得，因而用于纳豆激酶生产菌的产酶性能就显得至关重要[4]。

纳豆激酶生产菌属细菌科，芽孢杆菌属，是枯草芽孢杆菌的一个亚种[5]，常用的提高纳豆激酶产量的途径主要有3种：对野生菌种的诱变选育；优化纳豆激酶生产菌的发酵条件；通过基因工程技术改造纳豆激酶的相关基因[6]。本研究通过对纳豆激酶生产菌菌株进行紫外线诱变处理，选育溶栓活力较高的纳豆激酶生产菌，为今后的纳豆激酶扩大化生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌种

纳豆激酶生产菌（吉林农业科技学院生物工程学院实验室保藏）。

1.2 试剂

琼脂糖购自Spanish公司，纤维蛋白原，凝血酶及尿激酶购自Sigma公司，其他常规试剂为国产分析纯。

1.3 培养基

肉汤液体培养基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，pH 7.0～7.2，0.1Mpa灭菌20min。

加倍肉汤液体培养基：牛肉膏1%，蛋白胨2%，氯化钠1%，pH 7.0～7.2，0.1Mpa灭菌20min。

纤维蛋白平板：纤维蛋白原20mg溶解于10mL PBS缓冲液中，50℃水浴待用。取凝血酶50μL（浓度为200μL/mL）的加入到10mL含2%琼脂糖的PBS缓冲液中50℃水浴待用。将纤维蛋白原和含有凝血酶的溶液迅速混匀，倒入直径6cm的平板内，放入4℃冰箱备用。

1.4 试验方法

1.4.1 紫外线物理诱变

挑取纳豆激酶生产菌1环于盛有5mL肉汤的三角瓶中，置30℃过夜。

次日添加5mL新鲜的肉汤培养液，充分混匀后，继续培养5h，分装于2瓶三角瓶中。

任取1支5mL培养好的菌液倒入离心管中，1350转/分离心10min。

弃去上清液，打匀沉淀，加入生理盐水，稀释为细胞浓度为108个/mL的菌悬液。

20W紫外燈预热30min后，取制备好的菌悬液3mL移入无菌培养皿内（含一无菌转子），置于紫外灯下30cm处的磁力搅拌器上，开启培养皿盖后，在搅拌的条件下，紫外线照射分别为30s，60s，90s，120s和150s。

紫外线处理后的平皿中加入3mL加倍肉汤培养液，即用无菌遮光布包裹后放置于30℃恒温培养箱内，避光培养24h。

计算致死率与正突变率，并使用纤维蛋白平板测定酶活力，并以相同的操作取未经诱变处理的菌液作为对照，选取产酶活最高的菌液转接到发酵培养基中进一步摇瓶复筛，筛选出产酶较高的突变菌株。

1.4.2 致死率与正突变率的计算

紫外线物理诱变后菌株的致死率与正突变率计算公式[7]如下：

致死率（%）=[（未诱变平板菌落数-诱变后平板菌落数）/未诱变平板菌落数]×100

正突变率（%）=（酶活增加的菌株数/总菌株数）×100（正变株指酶活高于出发株的变异株）

1.4.3 纳豆激酶酶活性检测方法

在纤维蛋白平板上打直径2mm的圆孔，吸取发酵液上清3μL点样，静置10min后放入37℃恒温培养箱中，培养18h，测定透明圈的垂直直径。根据尿激酶纤维蛋白溶解酶标准曲线，计算纤维蛋白溶解酶的酶活[8，9]。

2 结果与讨论

2.1 紫外线诱变条件的确定

紫外线广泛地被用作微生物诱变剂，它可使DNA分子形成嘧啶二聚体，阻碍碱基正常配对，并可能引起突变或死亡[10]。为研究紫外线照射时间对诱变效果的影响，本研究使用的紫外灯功率为20W，照射距离为30cm，照射时间分别为30s，60s，90s，120s和150s，紫外诱变时间与正突变率与致死率关系的曲线见图1和图2。结果表明起初正突变率随着紫外诱变时间的增加而升高。当紫外线照射时间为90s时，正突变率为2.12%，此后，正突变率随诱变时间增加而下降。随着紫外线照射时间的延长，菌体细胞内的DNA分子所形成的嘧啶二聚体持续增加，从而影响菌体细胞分裂与增殖，导致致死率逐渐增加，当照射时间为90S时，致死率为79%。

2.2 紫外线诱变结果

通过对纳豆激酶生产菌株进行紫外线诱变共筛选出3株产纳豆激酶活力较高的突变株。紫外线诱变结果见表1。其中菌株2的纳豆激酶活力最高，为498.84U/mL，菌株1和菌株3的产纳豆激酶活力分别为495.36U/mL和486.23U/mL，均低于菌株2，而作为对照的纳豆激酶生产菌出发菌株产酶活力为467.18U/mL。因此，本研究中经紫外线物理诱变得到产纳豆激酶活力最高的正突变菌株为菌株2，其纳豆激酶活力比原始菌株提高了6.78%。

本试验研究了纳豆激酶生产菌紫外线物理诱变的条件。确定了紫外线诱变条件为20W紫外灯照射距离30cm，照射时间90s，正突变率为2.12%，致死率79%，获得了一株产酶活力为498.84U/mL正突变株，比原始菌株提高了6.78%。在本研究的基础上，可以进一步进行复合诱变，并优化菌株的发酵条件，用于之后的纳豆激酶扩大生产。

参考文献

[1]Sumi H，Hamada H，Tsushima H，et al. A novel fibrinolytic enzyme （nattokinase） in the vegetable cheese Natto；a typical and popular soybean food in the Japanese diet [J].Experientia，1987，43（20）：1110-1111.

[2]杨艳燕，李顺意，高尚，等.豆豉中纳豆杆菌的筛选和纳豆激酶的初步分离[J].沈阳药科大学学报，2001，18（6）：436-438.

[3]刘柳，彭喜春.纳豆激酶与豆豉纤溶酶酶学性质比较研究[J].中国酿造，2010，29（8）：88-90.

[4]夏丽，沙维，张丽萍.紫外线诱变选育高产纳豆激酶菌株的研究[J].农产品加工（创新版），2010，206（4）：9-34.

[5]刁建中，陈桂光，马波，等.纳豆激酶的最新研究进展[J].轻工科技，2012（3）：7-8.

[6]陈志文，徐尔尼，肖美燕.纳豆激酶的研究进展[J].山西食品工业，2002（1）：26-35.

[7]赵斌，何绍江.微生物学实验[M].北京：科学出版社，2002：187-191.

[8]江晓，董明盛.一种食源性纤溶酶（纳豆激酶）酶学性质研究[J].中国酿造，2002（1）：23-25.

[9]谢秋玲，郭勇.纳豆激酶活性测定方法[J].广东药学，2000，10（6）：8-10.

[10]李荣杰.微生物诱变育种方法研究进展[J].河北农业科学，2009，13（10）：73-78.

作者简介：薛健（1979-），男，讲师，研究方向：代谢工程与发酵过程优化。