(泰州学院，江苏 泰州 225300)



溶菌酶的分离方法及进展

宋娟

(泰州学院，江苏 泰州 225300)

溶菌酶是一种生物酶，可选择性地分解微生物的细胞壁。作为一种天然安全的杀菌剂、防腐剂，溶菌酶在医药、食品行业、饲料工业得以广泛的应用。本文综述了溶菌酶生产工艺中各种分离方法及其进展，对未来溶菌酶的分离纯化进行了展望。

溶菌酶 ； 分离 ； 纯化

Keywords:lysozyme ； separation ； purification

溶菌酶又称胞壁质酶，是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶，广泛存在于人和高等动物的组织、分泌物及体液中，鸟类和家禽的蛋清以及微生物中也含此酶，其中以新鲜鸡蛋清中含量最为丰富[1]。溶菌酶本身无毒，它可以在不破坏其他组织的前提下，选择性地分解微生物的细胞壁。这一特性使其成为一种天然安全的杀菌剂、防腐剂，在医药、食品行业、饲料工业得以广泛的应用[2-7]。此外，溶菌酶还可以被用作基因工程和细胞工程中细胞融合操作必不可少的工具酶，应用价值极高[8]。近年来，随着生物分离技术的不断推陈出新，溶菌酶分离纯化的方法也愈来愈多，从传统的结晶法到离子交换法和色谱法，再到后来的新技术如膜分离技术、超滤法和亲和—膜过滤技术等[9]。本文就近年来常用的一些分离纯化方法进行综述。

1 分离纯化方法

1.1结晶法

结晶法是制备溶菌酶晶体最传统的一种方法，1937年MayerAbraham等获得结晶溶菌酶之后，Alderton等[10]在1945年提出了直接结晶法。该法根据溶菌酶耐热、耐酸，在盐溶液中易溶且稳定性好的特性，加入中性盐使其溶解。然后利用溶菌酶和其他物质等电点的差异，调节溶液的pH值使其析出。结晶法操作简单但生产周期长，虽然经过重结晶可得到高纯度的溶菌酶，不过原料损耗相对较大，产率一般为60%～80%。杨景芝等[11]对传统方法进行改进，在加入中性盐之前用724树脂进行吸附，随后将洗脱液进行盐析，透析后调整透析液pH值，二次调整其pH值，加入磷酸缓冲溶液，最后离心去除杂质得到纯化液。经过改进，从鸡蛋清中提取溶菌酶的产率提高，并且活性增加。因为结晶法要求溶菌酶的含量相对较高，对于微量的溶菌酶分离效果较差，所以目前除了蛋清，其他来源的溶菌酶分离纯化一般不采用结晶法。

1.2离子交换法

离子交换法一直是分离纯化溶菌酶常用的方法，是利用溶液中各种带电粒子与离子交换剂之间结合力的差异来分离纯化物质的一种方法。因为溶菌酶为碱性蛋白质，最适宜酸度pH值为6.5，故可利用弱酸型阳离子交换树脂对其进行分离，然后再用氯化钠或硫酸铵溶液洗脱，达到分离的目的。该法简便、高效、成本低，可实现自动化连续操作。常用的离子交换剂有Duolite-464、羧酸纤维素(PC)、羧甲基纤维素(CMC)和羧甲基琼脂糖等[12]。李蓉等[13]选择硅胶基质交换柱，建立了比传统的软基质离子交换分离速度快、纯化效率高的新方法。将蛋清样品匀浆后，用NaCl初步纯化，然后用硅胶基质弱阳离子交换柱XIDACE-WCX分离，溶菌酶纯化倍数提高了5.6倍。溶菌酶活性回收率为107%，蛋白的比活为15 467 U/mg。余海芬等[14]探索出一种高收率、高活性的鸡蛋清溶菌酶提取技术，选用D152阳离子交换树脂，确定了最佳提取条件，得率为2.95 mg/mL，比活为9 500 U/mg左右，纯度为96.3%。赵林等[15]将蛋清稀释后先利用等电点沉淀去除部分杂质，然后利用快流速羧甲基—琼脂糖凝胶柱层析进行纯化。得到的溶菌酶纯度达到95%以上，比活达到17 600 U/mg，收率达到4.2 mg/mL，比余海芬等收率高约42.4%，比活也提高很多，高效快速地完成了蛋清溶菌酶的纯化。离子交换法提取分离蛋清中溶菌酶，设备简单成本低，操作方便周期短，且所得溶菌酶活力和收率较高，适合工业化生产。

1.3色谱法

色谱法以亲和力为基础，制备具有特异亲和性的分离介质，选择性地吸附生物活性物质，再依据待分离物质的特性选择适合的溶液洗脱而达到分离的目的，其中以20世纪80年代末发展起来的亲和色谱技术应用最广。亲和色谱又称为亲和层析法，是根据酶与作用底物的特异性亲和能力，利用酶分子独有的专一性结合位点或结构性质的分离方法，它的选择性好、高效快速，能够满足蛋清溶菌酶高效分离与纯化的需要。HeL Z等[16]采用多步亲和层析法分离纯化溶菌酶，结果表明，利用三步亲和层析系统对溶菌酶进行纯化，可以将产率从一步法的61%提高到96%。王建山等[17]利用一种新型的强阳离子交换/疏水色谱(SCX/HIC)双功能色谱柱构建了在线单柱二维液相色谱(2DLC-1C)，利用在线2DLC-1C技术在70 min内完成了对鸡蛋清中溶菌酶、卵清蛋白和卵转铁蛋白三种活性蛋白的快速分离纯化，其纯度分别为95%、93%和97%。该分离系统实现了自动控制，操作简单，易于放大，纯化速度快，有望广泛应用于活性蛋白的快速分离制备和工业化生产。

1.4膜分离技术

膜处理技术是指在一定的驱动力下，使溶液通过一定孔径的膜，达到浓缩溶质或净化溶剂的效果，通称为膜分离技术。工业化的膜分离过程主要有：微滤、超滤、反渗透、渗析、电渗析、气体分离和渗透汽化。近来，研发人员以传统的膜处理为基础，将亲和配基结合在分离膜上，利用亲和配基与目标分子进行特异性结合，杂质则大部分透过膜孔流出，通过洗涤除去膜上残留的杂质，然后将目标分子从膜上洗脱下来。它具有耗时短、反应温和、纯化效率高等特点，可作为分离、纯化DNA和蛋白质等生物大分子的新型技术手段，现已广泛运用。李静等[18]用金属螯合物作为配基的亲和膜分离纯化溶菌酶，实验结果表明，亲和膜对溶菌酶的选择吸附性能良好，可以用亲和膜直接从蛋清(壳)中分离提纯溶菌酶，纯度达17 500 U/mg。Bayramoglu G等[19]采用一种新型亲和染料—配基复合膜对溶菌酶的吸附及动力学特征进行了研究。他们还将活性绿19固定在甲基丙烯酸羟乙酯壳聚糖复合膜上，使得溶菌酶在上面的吸附量相比于普通复合膜的提高了9倍[20]。

1.5超滤法

超滤是一种新兴的分离纯化物质的技术，它以压力为动力，利用超滤膜不同孔径对液体进行分离的物理筛分过程，具有产品得率高、杂质少、纯度高等优点，一般应用在反渗析和浓缩等方面，近来也在蛋白质的分离纯化中得到越来越多的应用。在无菌条件下操作，可以直接生产无菌的溶菌酶溶液，直接用于临床治疗[21]。如果在原料液中加入亲和载体，再与传统超滤技术相结合，而实现特异性分离目标产物的技术叫作亲和—膜过滤技术。这项技术由Medda于1981年首次提出，它是首先利用相对分子质量较高的水溶性分子化合物为载体基质，在基质上耦连一定量能够特异性结合目标分子的亲和配基以获得亲和载体[22]。再利用亲和载体亲和吸附目标蛋白质分子结合形成大分子复合物，通过超滤膜进行超滤分离。此时超滤膜可以完全截留大分子复合物，而杂质分子则透过滤膜，接着用洗脱液解吸大分子复合物，使亲和载体和目标分子分离后再次通过超滤膜。这次大分子亲和载体将被截留，而目标蛋白质分子则通过滤膜得以纯化[23]。陈萍等[24]以200 kDa的水溶性葡聚糖为基质，Cu2+做亲和配基的大分子水溶性葡聚糖亲和—超滤载体对溶菌酶的吸附分离特性。结果表明亲和—超滤载体与溶菌酶的吸附能够在短时间内达到吸附平衡，拟合最大理论吸附量为13.65 mg/g，亲和—超滤载体有良好的重复使用特性，且平均洗脱率约达92%。

2 展望

溶菌酶由于其广泛用途，成为生化领域研究的热点，而溶菌酶的分离与纯化方法更是研究的重点。目前因为鸡蛋清中溶菌酶的含量较高，国内外主要从鸡蛋清中提取溶菌酶，但是，即使在鸡蛋清中的溶菌酶含量较高，也相当有限。为了满足人们对溶菌酶越来越大的需求，探讨高效的溶菌酶分离技术，提高溶菌酶生产质量，降低生产成本，适应各种应用的需求，势在必行。单一分离纯化方法往往存在纯度不高、回收率低和自动化难以实现的问题，因此需要建立多阶段复合的分离纯化体系，再结合基因工程及蛋白质工程，建立重组溶菌酶的微生物表达系统，获得能够稳定表达出高活性溶菌酶的高产表达菌株，来提高溶菌酶产量和效率满足大规模生产的需求。

[1] 方元超,梅丛笑,尹 宁.溶菌酶及其应用前景[J].中国食品添加剂,1999,4:39-42.

[2] 林尚泽.口咽部恶性肿瘤患者在化—放疗过程中溶菌酶的应用[J].国外医学·耳鼻咽喉科学分册,1982,5:290-291.

[3] 潘 洛,杨光伟,周怀理.溶菌酶含片预防放射性口咽反应的临床疗效观察[J].肿瘤药学,2014,4(4):294-297.

[4] 崔 红.天然微生物防腐剂溶菌酶在食品中的应用研究[J].中国食物与营养,2015, 21(12):28-31.

[5] 冯棋琴,周立梅,高文功,等.溶菌酶在食品工业中的研究进展[J].食品研究与开发,2015，36(5):134-136.

[6] 张瑞姿,赵雪敏,郭 曦,等.溶菌酶及其在饲料工业中的应用[J].兽药与饲料添加剂,2009,14(5):16-18.

[7] 邢思华,华雪铭,朱站英,等.渔用溶菌酶制品的稳定性研究[J].饲料工业,2014,22:20-23.

[8] Paola A,Joseph H.H.Immobilization of lysozyme on food contact polymers as potential antimicrobial films[M].Packaging Technology and Science,1997,10:271-279.

[9] 林 立.溶菌酶分离方法综述及进展[J].广州化工,2012,40(7):53-56.

[10] Alderton G,Ward W,Fevold H.Isolation fo lysozyme from egg white[J].Journal of Biological Chemistry,1945,157:43-58.

[11] 杨景芝,孙衍华,白吉刚,等.鸡蛋清溶菌酶提取工艺的改进[J].食品与发酵工业,2004,30(5):85-87.

[12] Lichan E,Nakai S,Sim J,et al.Lysozyme sepraration from eggwhite by cation exchang column chromatography[J].Journal of foodscience,1986,51(4):1032-1036.

[13] 李 蓉,陈国亮.高效阳离子交换色谱法分离纯化蛋清中的溶菌酶[J].色谱,2002,20(3):259-261.

[14] 余海芬,马美湖,刘 岩.阳离子交换法提取蛋清溶菌酶的研究[J].中国家禽,2008,30(24):22-25.

[15] 赵 林,蔡金艳,周 林等.一步阳离子柱层析高效纯化溶菌酶及其溶菌活性[J].中国药房,2013,24(1):30-32.

[16] HeL Z,Sun Y.Purification of lysozyme by multistage affinity filtration[J].Bioprocess Biosyst Eng,2002,25:155-158.

[17] 王建山,夏红军,万广平,等.在线单柱二维液相色谱法对蛋清中三种活性蛋白的快速分离纯化[J].化学学报,2016,74:265-270.

[18] 李 静,陈欢林,柴 红.金属螯合亲和膜吸附分离与纯化溶菌酶的研究[J].膜科学与技术,2001,21(4):5-9.

[19] Bayramoglu G,Yglmaz M,Arica M Y.Affinity dye-ligand poly(hydroxyethyl ethacrylate) /chitosan composite membrane for adsorptionlysozyme and kinetic properties[J].Biochemical Engineering Journal,2003,13(1):35-42.

[20] Yilmaz M,Bayramoglu G,Arica MY.Separation and purification of lysozyme by Reactive Green 19 immobilised membrane affinity chromatography[J].Food Chemistry,2005,89(1):11-18.

[21] 陈慧英,吴晓英,林 影.溶菌酶分离纯化方法的研究新进展[J].广东药学院学报,2003,19(4):355-258.

[22] Adamsi M D,Nguyen Q T,Dellacherie E.[J].Membrane Science,1981,9(3):337-342.

[23] 李存芝,李 琳,胡松青,等.亲和—膜过滤技术及其应用[J].现代化工,2004,1(24):64-66.

[24] 陈 萍,赵 玮,李 琳,等.水溶性葡聚糖亲和—超滤载体对溶菌酶吸附分离特性的研究[J].食品工业科技,2011,32(8):84-86.

SeparationMethodsandProgressofLysozyme

SONGJuan

(Taizhou University，Taizhou 225300 , China)

Lysozyme is a kind of biological enzyme,which can selectively decompose cell wall of microorganisms.As a kind of natural and safe baltericide and antiseptic,lysozyme is widely used in medicine,food industry and feed industry.In this paper,the separation methods and progress of lysozyme production are reviewed.The separation and purification of lysozyme in the future is prospected.

2017-04-10

宋 娟(1977-)，女，副教授，从事应用化学方面的工作，电话：13912193222。

TQ426.9

：A

：1003-3467(2017)07-0016-03