李月双，姚 静，谢婷婷，潘 杰，李沛军，陈从贵*

（合肥工业大学食品科学与工程学院，安徽 合肥 230009）

超高压对肌球蛋白-抗性玉米淀粉混合凝胶特性的影响

李月双，姚 静，谢婷婷，潘 杰，李沛军，陈从贵*

（合肥工业大学食品科学与工程学院，安徽 合肥 230009）

以添加质量分数0.6%抗性玉米淀粉（resistant corn starch，RCS）的鸡胸肉肌球蛋白（myosin，M）混合（M-RCS）体系为研究对象，考察超高压（ultra high pressure，UHP）处理（100～400 MPa，10 min）对该体系凝胶保水性（water holding capacity，WHC）和硬度的影响；并通过分析M-RCS体系表面疏水性、活性巯基含量、流变特性及凝胶水分子横向弛豫时间的变化，探讨其凝胶特性的变化机制。结果表明：M-RCS凝胶的WHC随着压力的增大（100～400 MPa）而显著增加（P＜0.05），硬度则显著降低（P＜0.05）；UHP通过增加M-RCS体系的疏水基团和活性巯基数量，减小其储能模量G′，改变其黏弹性tanδ，缩短凝胶内部水分子弛豫时间T22和T23，减弱体系内水分的流动性，进而改变了凝胶的WHC和硬度。实验结果可为低脂、高膳食纤维肉制品的开发提供理论依据。

超高压；抗性玉米淀粉；肌球蛋白；凝胶品质特性

抗性淀粉是一类低热量、类似膳食纤维的变性淀粉，可促进人体健康[1-2]，具有降低血清胆固醇、调节血糖、预防结肠癌等生理功能[3-5]。抗性淀粉应用于肉与肉制品，还可改善质构、保水等品质特性[6]，并可提高其冻融稳定性[7]。肌球蛋白（myosin，M）既是肌肉中含量最多也是形成凝胶的蛋白质，其凝胶保水性（water holding capacity，WHC）和硬度直接影响肉制品的质量[8]。

超高压（ultra high pressure，UHP，压力＞100 MPa）处理是一种非热加工技术，具有操作方便、作用时间短、物料受压均匀等优点[9]；室温条件下可形成杀菌、钝化酶活和延长货架期等作用，且对肉制品营养品质和感官特性无显著影响[10]。邱志敏等[11]研究发现，UHP（200～400 MPa）可能通过使肉糜中肌原纤维蛋白变性及强化盐桥作用，或通过电致伸缩作用破坏二价阳离子与蛋白质之间的键合作用，显著增强了肉糜-变性淀粉的保水和质构特性（硬度、咀嚼性）。Chen Xing等[12]发现，UHP促使M变性、展开，活性基团（活性巯基、疏水基团）增多，增加了M与多糖的聚集作用，并由此改变M-多糖的凝胶微观结构，增强了凝胶结构束缚水的能力，致使M-多糖混合凝胶的WHC增加、硬度降低。史可夫等[13]研究表明，UHP还可通过增加M-海藻酸钠（多糖）-氯化钙混合凝胶体系内部的活性巯基含量，强化混合体系内部的疏水作用，弱化海藻酸钠和氯化钙对M凝胶的增强作用，降低了M的热凝胶能力以及凝胶网络结构的蛋白质聚集程度，进而引起凝胶保水性的增加和硬度的减弱。然而，UHP影响M-抗性淀粉混合体系凝胶特性的研究鲜见文献报道。

本研究以添加抗性玉米淀粉（resistant corn starch，RCS）构成M-RCS混合体系为对象，研究UHP对该体系凝胶特性（保水性和硬度）的影响，并探讨其变化机制，为UHP技术处理M结合RCS在低脂、功能肉制品中的开发应用提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

原料：鸡胸肉 市售；RCS 南通云峰淀粉有限公司。

氯化镁、氯化钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、焦磷酸钠、乙二胺四乙酸二钠 国药集团化学试剂有限公司；二硫苏糖醇、曲拉通X-100、三磷酸腺苷二钠、8-苯胺基-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid hydrate，ANS） 生工生物工程（上海）股份有限公司；5,5’-二硫代-2-硝基苯甲酸（5,5’-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB） 阿拉丁试剂有限公司；所有试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

BD(C)-69冷藏柜 青岛澳柯玛股份有限公司；BC/BD-241GS冰柜 青岛海尔集团公司；GL-21M高速离心机 湖南湘仪离心仪器有限公司；DS-1高速组织捣碎机 上海越磁电子科技有限公司；FA25高剪切乳化机 上海弗鲁克流体机械制造有限公司；HPP.L2B 600MPa/0.6L超高压试验台 天津华泰森淼生物科技有限公司；TA-XT Plus质构仪 英国Stable Micro System公司；HH-2数显水浴锅 江苏金坛市环宇科学仪器厂；HR-3型流变仪 美国TA公司；PQ001纽迈台式脉冲核磁共振仪 上海纽迈电子有限公司；Power wave全波长扫描酶标仪 美国Bio-Tek公司。

1.3 方法

1.3.1 M提取

剔除鸡胸肉中可见脂肪与结缔组织，切碎、称质量约300 g；参照Zhou Yanzi等[14]的方法提取M；并用0.6 mol/mL氯化钾磷酸盐缓冲液（pH 6.5）将M质量浓度标准化到20 mg/mL。为防止M变性，所有操作在0～4 ℃环境下进行。

1.3.2 M-RCS溶胶制备

向150 g的M溶液（20 mg/mL）中加入质量分数0.6% RCS，在4 ℃条件下缓慢搅拌20 min，至完全溶解，在冰箱中（约4 ℃）静置过夜（约12 h），形成M-RCS混合溶胶。

1.3.3 UHP处理条件

将上述M-RCS混合溶胶缓慢注入到聚乙烯袋（长25 cm、宽18 cm）内，真空包装、密封；再将聚乙烯袋装入另一聚乙烯袋内，并注入约4 ℃的冷水，真空密封后进行UHP。压力水平设为0.1（未加压）、100、200、300、400 MPa，保压时间10 min，加压介质温度20 ℃。样品加压前后均需置于冰袋中保存，受压的M-RCS溶胶冰浴保存约12 h后，供热凝胶处理或检测。

1.3.4 M-RCS凝胶制备

称取受压后M-RCS混合溶液（10±0.3） g，置于10 mL小烧杯（Ф27 mm×35 mm）内，用保鲜膜封口；放入20 ℃水浴中恒温10 min，然后以平均2 ℃/min的升温速率，加热至80 ℃后保温30 min；取出小烧杯，冰水浴冷却10 min，于4 ℃条件下冷藏12 h，得到M-RCS凝胶，供检测。

1.3.5 WHC测定

参照Zhou Yanzi等[14]的方法，并稍微修改。取出M-RCS凝胶样品，置于质量m0离心管中，凝胶与离心管总质量为m1，在4 ℃、1 000×g条件下离心10 min，离心后用吸水纸除去管内与凝胶表面的水分，称质量m2。检测重复7 次。WHC按式（1）计算。

1.3.6 凝胶强度测定

利用TA-XT Plus质构仪GMIA程序测定M-RCS凝胶强度，单位为g。测定参数为：探头选用P/0.5，测前速率1.50 mm/s，测中速率1.00 mm/s，测后速率1.00 mm/s，穿刺距离4 mm，触发力5 g。检测重复7 次。

1.3.7 流变性质测定

参照Verbeken等[15]的方法并作修改。流变仪采用振荡模式，检测参数为：平行板直径40 mm，狭缝1 mm，应变2%，振动频率0.1 Hz。测试过程包括升温和降温2 个阶段，升温速率2 ℃/min，温度变化范围为20～80 ℃；降温速率4 ℃/min，温度变化范围为80～20 ℃。分别记录升温、降温过程中的储能模量（G’）、相位角正切值（tanδ）的变化。每个处理平行测定3 次。

1.3.8 表面疏水性测定

参照Chen Xing等[12]方法，将M-RCS溶胶用0.6 mol/mL氯化钾-磷酸盐缓冲液（pH 6.5）稀释到蛋白质质量浓度1.0 mg/mL，取4 mL样品稀释液，加入20 μL 15 mmol ANS（磷酸盐缓冲液，pH 6.5），充分振荡混合均匀，25 ℃反应20 min，吸取200 μL反应液于酶标板内，在激发波长380 nm、发射波长470 nm条件下检测其荧光强度。每个处理平行测定5 次。

1.3.9 表面活性巯基含量测定

参照Chen Xing等[12]方法，取1.3.8节蛋白质质量浓度1.0 mg/mL样品稀释液4 mL，加入10 mmol/L DTNB溶液50 μL，充分振荡混合均匀，避光反应20 min，以添加50 μL 10 mmol/L DTNB的4 mL 0.6 mol/mL氯化钾-磷酸盐缓冲液作为对照，在412 nm波长处测定其吸光度A412nm。检测重复5 次。巯基含量计算见公式（2）：

式中：A412nm为吸光度；D表示稀释倍数；C蛋白为M质量浓度/（mg/mL）。

1.3.10 低场核磁自旋弛豫时间测定

参照Han Minyi等[16]的方法并作修改。采用低场核磁共振技术检测，在微型核磁共振成像仪上进行，约2～4 g样品放入直径25 mm核磁管中，质子共振频率为18.169 MHz，磁体强度0.43 T，自旋-自旋弛豫时间T2用Carr-Purcell-Mebiboom-Gill（CPMG）序列进行测量，其中回波时间（TE）为400 μs，15 000个回波，重复扫描4 次，重复等待时间8 000 ms，得到指数衰减图形使用SIRT算法拟合得到T2谱图。

1.4 数据处理

采用Excel 2007软件进行数据分析；采用t检验进行显著性分析，显著性水平取P＜0.05；采用Origin 8.5软件作图。

2 结果与分析

2.1 UHP对M-RCS凝胶品质特性的影响

2.1.1 UHP对M-RCS凝胶WHC的影响

图1 UHP对M-RCS凝胶WHC的影响Fig.1 Effect of UHP on WHC of M-RCS gels

如图1所示，未受压（0.1 MPa）时，添加的RCS可提高M凝胶的WHC；而UHP（100～400 MPa）可进一步提高M-RCS凝胶的WHC（P＜0.05），且随着压力的升高，凝胶WHC增加显著。任云霞等[17]通过实验观察到UHP（100～400 MPa）可提高鸭肉肌原纤维蛋白-变性淀粉混合体系凝胶的WHC，且保水性随着压力的增大而提高；推断400 MPa以下的UHP会导致肌原纤维蛋白的解聚，从而增大了蛋白的溶解度，促进了变性淀粉与蛋白的结合，进而提高了WHC。

Chen Xing等[12]发现，UHP可能通过改变M-卡拉胶体系凝胶中的氢键数量、水分子流动性以及微观结构等来提高其WHC。还有研究表明，UHP可导致淀粉膨胀率的增加[18]，而对于受压M-RCS体系，RCS也可能吸水膨胀，使得M-RCS凝胶网络结构中截留更多的水，导致凝胶WHC增加。

2.1.2 UHP对M-RCS凝胶硬度的影响

图2 UHP对M-RCS凝胶硬度的影响Fig.2 Effect of UHP on gel strength of M-RCS gels

由图2可见，与未受压（0.1 MPa）的M-RCS凝胶相比，UHP（100～400 MPa）会显著降低凝胶的硬度（P＜0.05），且随着压力水平的提高，硬度依次降低；但压力超过300 MPa时，增压对硬度的影响不显著（P＞0.05）。此外，添加的RCS可显著增强未受压（0.1 MPa）M凝胶的硬度（P＜0.05），由此说明，UHP与RCS对M凝胶硬度的影响具有互补作用。

有研究认为，UHP导致的蛋白质变性，会在随后的热诱导凝胶化过程中降低凝胶网络结构间的交联程度，致使其硬度下降[12,19]。Pérez-Mateos等[20]认为，UHP可使肉蛋白充分变性展开，并与多糖发生更强烈的作用而形成更大的聚合物，而在卸压后的热诱导凝胶过程中，这类聚合物会对蛋白凝胶的形成产生阻碍作用，导致肉糜凝胶硬度的下降。Chen Xing等[12]认为，蛋白凝胶网络结构的形成主要依赖于蛋白质的变性、展开和聚集，且凝胶化程度与蛋白变性和聚集的速率有关，UHP会限制蛋白-多糖体系中蛋白的变性和聚集，弱化了蛋白与蛋白、蛋白与多糖间的作用，导致其凝胶硬度下降。而邱春强等[21]发现，UHP通过使肉蛋白变性，可显著提高盐溶蛋白-瓜尔胶凝胶的硬度和强度。也有学者对受压肉糜-变性淀粉混合体系研究发现，100～500 MPa的压力可使肉蛋白充分变性，形成致密、精细的凝胶网络结构，从而提高了凝胶的硬度和强度[11]。可见，受压体系不同，结果可能各异，UHP影响肉蛋白凝胶质构的本质还有待进一步研究。

2.2 UHP对M-RCS混合溶胶表面疏水性与活性巯基的影响

蛋白质三级和四级结构的稳定由其侧链间形成的氢键、疏水作用、静电作用、范德华力和二硫键等维持[20]。表面疏水性、活性巯基含量的变化将引起蛋白质三级结构的改变，并导致蛋白质功能性质的变化[15]。如图3所示，与未受压组（0.1 MPa）比较，UHP（100～400 MPa）能显著增加M-RCS体系的表面疏水性和活性巯基含量（P＜0.05）；且随着压力的增加，表面疏水性依次增强，活性巯基含量依次增多。

图3 UHP对M-RCS体系表面疏水性（A）和活性巯基含量（B）的影响Fig.3 Effect of UHP on surface hydrophobicity (A) and reactive sulfhydryl group content (B) of M-RCS gels

Alvarez等[22]研究指出，UHP会提高蛋白质分子的展开程度，从而使ANS分子易于进入蛋白质的疏水核心区域，引起荧光强度的增强（疏水性变大）。Zhang Hongkang等[23]认为，受压蛋白巯基数量的增多，可能是由二硫键（S—S）的断裂还原引起的。而Cao Yingying等[24]研究认为，由于UHP提供的能量有限（10 000 MPa的压力仅可提供约8.37 kJ/mol的能量），远低于S—S键断裂需要的能量（213.30 kJ/mol），只会导致M分子结构的变化，使得蛋白分子暴露出更多的内部活性巯基，从而导致表面活性巯基数量的增加。由此可以推测，UHP（100～400 MPa）诱导的M分子变性展开，暴露了更多的内部疏水残基和巯基，进而显著提高了M-RCS体系的表面疏水性和活性巯基含量（图3）。

Chen Xing等[12]研究认为，UHP促使蛋白-多糖体系中活性巯基和疏水基团数量增加，增强了体系内的氢键和疏水作用，阻碍了凝胶中的水分流动，提高了WHC。而受压M-RCS体系中活性巯基和疏水基团含量的增加，可能是导致其WHC增加（图1）的诱因。而UHP诱导的M分子变性展开，也可能会降低受压M-RCS体系在热凝胶化过程中蛋白分子之间交联程度，从而导致其凝胶硬度的下降（图2）。

2.3 UHP对M-RCS混合溶胶流变特性的影响

图4 UHP对M-RCS体系升温（A）和降温（B）过程中储能模量（G’）的影响Fig.4 Effect of UHP on storage modulus (G’) of M-RCS gels during heating (A) and cooling (B)

储能模量G’值反映黏弹性体系中弹性部分，数值越大，弹性部分越强。如图4A所示，在20～80 ℃的热诱导凝胶过程中，UHP会导致M-RCS体系G′值的显著减小，而且在100～300 MPa范围内，随着压力的增大，减小的程度越显著。未受压（0.1 MPa）的M-RCS溶胶在热诱导凝胶过程中出现两个峰，一个为50 ℃左右的凝胶“形成”阶段，该阶段是由于M分子的头部和铰链部分变性、聚合引起，随后M分子尾部发生变性而进入凝胶“减弱”阶段；另一个为66 ℃左右的凝胶“增强”阶段[25]。100～200 MPa的UHP可使M-RCS体系的凝胶“形成”峰温度发生右移，并在凝胶“减弱”阶段后，G’值虽持续增加，但第2个峰消失；当压力增至300～400 MPa时，受压M-RCS体系的G′值缓慢增加，而两个峰均完全消失。有研究表明，UHP可阻碍蛋白质在随后热诱导凝胶过程中的进一步变性和聚集，并对蛋白质起到一定的保护作用[26]。Cao Yingying等[24]在研究UHP对兔M凝胶机理时认为，活性巯基含量和表面疏水性的增加，预示着蛋白质变性程度增大，影响了热诱导凝胶的质构和黏弹性。

由图4B可知，受压M-RCS体系的G’值呈现随温度降低而增加的变化趋势，与未受压组（0.1 MPa）的变化趋势基本相同，表明受压与非受压M-RCS体系在冷却过程中，均能进一步促进三维凝胶网状结构的形成，表现出凝胶弹性的增加。但受压体系G’值增加的幅度却随着UHP压力的提高而减弱；且在温度降到20 ℃时，M-RCS体系的G’值依然显示出随着压力增加而减小的变化规律，这与UHP影响M-RCS体系凝胶硬度的结果（图2）相一致。此外，在压力超过200 MPa时，M-RCS体系的G’值曲线发生了微小变化，在67 ℃左右处出现了一个坡峰。这可能与UHP诱导的RCS颗粒吸水膨胀能力增强[18]有关；压力越高，RCS的变性程度可能越大，由此影响了M-RCS体系后续热凝胶化过程的特性表现，显示出凝胶弹性的波动。

图5 UHP对M-RCS体系升温过程中ttaannδ的影响Fig.5 Effect of UHP on tanδ of M-RCS during heating

δ值反映了蛋白质由黏性溶胶向弹性凝胶的转变。如图5所示，UHP改变了升温过程中M-RCS体系的tanδ。与未受压组（0.1 MPa）相比，100 MPa压力处理后，tanδ曲线形状没有显著变化，表明此压力对M-RCS体系的黏弹性影响较小，这也证明了相同条件下M-RCS体系G’值变化不显著的原因（图4A）。以前的研究也发现类似的现象[12]。当压力≥200 MPa时，tanδ线形发生较大幅度的波动，表明UHP诱导的黏弹性变化较大。此外，受压M-RCS体系在20 ℃时均表现出更强的黏性特征，其原因可能是受压M-RCS体系中M分子的变性、展开和RCS分子的变性，增强了M-RCS体系内部的相互作用，使得M-RCS体系变得更加黏稠。

2.4 UHP对M-RCS凝胶弛豫时间的影响

图6 UHP对M-RCS凝胶弛豫时间（T2）分布的影响Fig.6 Effect of UHP on T2relaxation time distribution of M-RCS gels

低场核磁共振中的弛豫时间T2反映体系中水分子自由度。由图6可知，在0～10 000 ms的T2分布上，T2出现3 个峰，分别对应于结合水T21（0～10 ms）、不易流动水T22（100～700 ms）和自由水T23（1 000～3 000 ms）。这类似于前期在M-多糖混合凝胶体系中所观察到的水分分布结果[14]：T21（3.05～14.17 ms）、T22（151.99～464.15 ms）和T23（1 232.85～1 873.82 ms），其差异可能与选择的磁体强度及核磁共振参数不同有关。与未受压组（0.1 MPa）相比，受压M-RCS凝胶体系中T22和T23对应的水分子T2峰值均发生了左移现象，即随着UHP压力的增大，T22值依次显著缩短（P＜0.05）；而T23虽然在100～300 MPa范围内无显著变化（P＞0.05），但是当压力达到400 MPa时，T23值也显著缩短（P＜0.05），结果见表1，反映出UHP会增强M-RCS凝胶体系对水分子的束缚能力，由此提高了WHC（图1）。

表1 UHP对M-RCS凝胶弛豫时间（T2222和T2233）的影响Table1 Effect of UHP on spin-spin relaxation times (T2222aanndd T2233)) ooff M-RCS ggeellss

此外，从T2对应的峰面积看（图6），所有样品中结合水对应的峰面积占比很小，表明其含量很低；而随着压力的提高，受压（100～400 MPa）凝胶中T22对应的峰面积占比减小，T23对应的峰面积占比却反而增大，反映出UHP会导致凝胶体系内自由水的含量增加，不易流动水的含量减少。这种水分分布现象与WHC之间的关系还有待进一步解析。

仪淑敏等[27]在观察含有淀粉的UHP鱼糜凝胶时发现，在100～400 MPa范围内，随着压力的增大，体系中蛋白质或淀粉大分子中亲水基团暴露增多，增加了水分子与之结合的机会，从而导致凝胶中对应不易流动水的T22缩短。Chen Xing等[12]也发现，UHP促进了M分子与卡拉胶之间的聚集，导致体系凝胶三维结构中空隙的减小，减弱了水分子的流动性，缩短了T22时间。很多研究表明，凝胶体系中水分子T2与其WHC有直接关系[28-29]，M-RCS体系凝胶的水分子T2的减小，表明体系中水分子的流动性变弱，M-RCS体系凝胶三维结构截留水的能力增强，最终导致WHC的增加（图1）。

3 结 论

UHP会导致溶胶体系内部M和RCS分子的变性，使得M分子暴露出更多的活性基团，如疏水基团和活性巯基，增强了疏水作用和氢键作用，并在随后热凝胶化过程中形成了聚集程度更大的凝胶结构，可截留更多的水分；同时，UHP还导致了M-RCS体系凝胶对水分的束缚能力增强，流动性变弱，进而提高了M-RCS体系凝胶的WHC。这些变化以及受压后M分子间距增大、RCS膨胀引起的位阻作用增强，导致M-RCS热诱导凝胶结构的交联程度降低、凝胶能力下降、黏弹性减弱，从而降低了UHP混合凝胶的硬度。

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Effect of Ultra High Pressure Processing on Gel Properties of Chicken Breast Myosin Containing Resistant Corn Starch

LI Yueshuang, YAO Jing, XIE Tingting, PAN Jie, LI Peijun, CHEN Conggui*
(School of Food Science and Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

The effect and mechanism of ultra high pressure (UHP) processing (100-400 MPa for 10 min) on the waterholding capacity (WHC) and hardness of chicken breast myosin gel containing 0.6% (m/m) resistant corn starch (RCS) (M-RCS) were investigated. The results showed that UHP at 100-400 MPa could significantly increase the WHC of M-RCS gels and decrease the gel hardness in a pressure-dependent manner (P ＜ 0.05). UHP could signif i cantly increase the hydrophobic groups and reactive sulfhydryl contents of M-RCS system (P ＜ 0.05), thereby reducing storage modulus (G’), changing viscoelasticity tanδ and shortening the transverse relaxation time T22and T23(P ＜ 0.05) to result in a higher WHC value and a lower hardness of the gel. UHP treatment is benef i cial to the development of low-fat and high-f i ber meat products.

ultra high pressure; resistant corn starch; myosin; gel properties

10.7506/spkx1002-6630-201703001

TS251.51

A

1002-6630（2017）03-0001-06

李月双, 姚静, 谢婷婷, 等. 超高压对肌球蛋白-抗性玉米淀粉混合凝胶特性的影响[J]. 食品科学, 2017, 38(3)： 1-6. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201703001. http：//www.spkx.net.cn

LI Yueshuang, YAO Jing, XIE Tingting, et al. Effect of ultra high pressure processing on gel properties of chicken breast myosin containing resistant corn starch[J]. Food Science, 2017, 38(3)： 1-6. (in Chinese with English abstract)

10.7506/ spkx1002-6630-201703001. http：//www.spkx.net.cn

2016-03-23

国家自然科学基金面上项目（31271893）

李月双（1989—），男，硕士研究生，研究方向为肉制品加工。E-mail：836954726@qq.com

*通信作者：陈从贵（1963—），男，教授，硕士，研究方向为肉制品加工及副产物综合利用。E-mail：ccg1629@163.com