周雅川 周学东 郑黎薇

口腔疾病研究国家重点实验室，国家口腔疾病临床研究中心，四川大学华西口腔医院，成都 610041

微小RNAs在牙釉质发育过程中的表达和作用

周雅川 周学东 郑黎薇

口腔疾病研究国家重点实验室，国家口腔疾病临床研究中心，四川大学华西口腔医院，成都 610041

微小RNAs（microRNAs）是一类内源性的短链非编码RNA，在转录后水平调控基因的表达，在各项生物发生过程中发挥重要的调控作用。牙釉质发育过程中任何信号的干扰和突变都可能导致牙釉质形成障碍。本文对miRNAs在牙釉质发育过程中的表达和作用机制进行综述。

微小RNA； 釉质发育； 成釉细胞； 表达

牙釉质是人体中最坚硬的矿化组织，由有序排列的羟磷灰石晶体组成，在人体中行使咀嚼、保护和美观等功能。牙釉质发育伴随着成釉细胞的分化和牙釉质基质的分泌、矿化过程[1]。发育过程中任何信号的干扰和突变都可能导致牙釉质形成的障碍，如釉质发育不全（amelogenesis imperfecta， AI）。

微小RNAs（m icroRNAs，miRNAs）是一类短链的非编码RNA，能与靶基因mRNA的3’端非编码区（3’ untranslated region，3’UTR）特异性地结合，在转录后水平调节基因的表达，在各项关键的生物发生过程中发挥了重要的作用[2-3]。本文概述了人及啮齿类动物牙釉质的正常结构及发育过程，总结了m iRNAs在釉质发育过程中的时空性表达谱，探讨了其参与的相关信号网络调控机制，从而对miRNAs在釉质发育过程中的表达及作用有深入的认识，为釉质发育相关的临床疾病的诊治提供理论基础。

1 釉质发育

1.1 牙釉质的结构特点

牙釉质是人体内高度矿化的坚硬组织，由小于1%的有机质和大量的无机成分构成，紧密排列的羟磷灰石晶体聚集成簇，形成釉柱和釉间柱交错的结构，为釉质的硬度和弹性提供了物质和结构基础[1,4-5]。釉质基质依赖于成釉系细胞的合成和分泌功能，然而伴随着牙齿的萌出，成釉细胞的凋亡限制了釉质的再生[5]。

啮齿类动物如小鼠的切牙釉质的结构与人牙釉质类似，但其只分布在切牙的唇侧。其牙釉质结构从内到外大致分为四层：内层无釉柱结构层、釉柱交错结构层、釉柱平行排列结构层、表层无釉柱结构层[6-7]。小鼠切牙的釉质随着切端的不断磨耗，具有终身生长的特点，因此成为研究釉质发育过程的最佳模型[8]。

1.2 牙釉质的发育过程

1.2.1 人牙釉质的发育过程 牙发育过程伴随着口腔上皮组织和间充质组织的相互作用。早期的牙胚发育始于口腔上皮层增厚，并内陷入间充质组织形成上皮蕾状结构。随着发育的进程，逐渐形成帽状期和钟状期牙胚[9]。钟状期牙胚的成釉器结构最终分化形成釉质。成釉器包括内釉上皮层（inner enamel epithelium，IEE）、中间层（stratum intermedium，SI）、星网状层（stellate reticulum，SR）和外釉上皮层（outer enamel epithelium，OEE）。从钟状期开始，IEE快速向成釉向序列性分化，依次形成前成釉细胞、前分泌期成釉细胞、分泌期成釉细胞和成熟期成釉细胞。前成釉细胞通过基底膜与牙本质细胞相邻，当成牙本质细胞开始分泌形成牙本质基质后，基底膜结构消失，前分泌期成釉细胞在牙本质基质矿化环境中进一步分化形成具有分泌功能的分泌期成釉细胞。分泌期成釉细胞靠近分泌端细胞膜形成典型细胞突起，称为Tomes突，分泌釉质基质蛋白，如釉原蛋白（amelogenin，AMEL）、成釉蛋白（ameloblastin，AMBN）、釉蛋白（enamelin，ENAM）[10]等，釉质层增厚。Tomes突含有分泌功能和无分泌功能的两侧细胞膜结构[11]，由此决定了釉质晶体的构象排列，为釉质的进一步矿化提供了支架结构。随着成釉系细胞的进一步分化，成熟期成釉细胞的分泌端细胞膜呈现锯齿状或平滑面两种交替变化的结构[12]，分泌基质蛋白酶[13]（如KLK4，MMP20等），降解基质蛋白，为釉质的矿化进行调整空间结构。随着釉质层的增厚和矿化过程，釉质的硬度不断加强，形成高度矿化的坚硬组织。

1.2.2 啮齿类动物的釉质发育过程 啮齿类动物如小鼠的牙胚发育大约始于胚胎期11.5 d（E11.5），而釉质层的出现始于出生后0 d（P0）[9]。小鼠切牙的釉质只存在于唇侧，与序列性分化的牙上皮细胞层伴行，完整地展示了成釉细胞分化和釉质形成的各个阶段。

小鼠切牙的根尖区包含两个干细胞龛称为颈环（cervical loop，CL），分别为唇侧颈环（labial cervical loop，laCL）和舌侧颈环（lingual cervical loop，liCL），其中只有唇侧颈环具有成釉向分化的能力。随着切端釉质的不断磨耗，颈环区前体细胞沿牙体长轴依次分化形成成釉系细胞[14]。前分泌期成釉细胞呈立方样，细胞核显著，分泌形成无釉柱结构的釉质；沿切端向移行分化形成的分泌期成釉细胞，细胞呈高柱状，分泌端形成突起结构分泌大量釉质基质到细胞外，釉质晶体成核并延长；成熟期成釉细胞呈矮柱状，此时釉质晶体的厚度和宽度显著增加，并矿化形成具有典型的4层牙釉质结构。

1.2.3 AI AI是指在釉质发育过程中由于各种因素的干扰导致釉质发育障碍。在不同发育阶段的异常干扰会导致不同的发育障碍表现[15-16]。例如，异常干扰发生在牙本质-釉质基底膜形成的阶段时，会导致釉质层易于从牙本质表面脱落。异常干扰发生在牙釉质基质分泌期时，会导致基质分泌不足形成菲薄的釉质层，为发育不良（hypoplasia）[17]。异常干扰发生在釉质基质矿化的成熟期时，会导致矿化程度降低形成松软的釉质结构，为矿化不良（hypomineralization）[18]。

2 m iRNAs的生物学功能

miRNAs是一类内源性表达的短链非编码RNAs，可以通过互补性结合在mRNA的3’UTR，在转录后水平调节基因的表达[19-20]。在人类基因组中已预测存在有500~800种m iRNAs，几乎所有的基因都受到m iRNAs的调控作用。大量研究[21-24]证明，m iRNAs在多项生物学活动中发挥重要作用，包括形态发生和器官形成过程。

成熟的功能性m iRNAs的合成是一系列酶联反应的结果。首先在细胞核内转录形成单链或发卡样的pri-m iRNAs，pri-m iRNAs被细胞核内Drosha酶剪切形成pre-m iRNAs，并转运到细胞质中，由细胞浆中的Dicer酶剪切形成成熟的单链m iRNA[25]。miRNA与Argonaute蛋白形成RNA介导的沉默复合体，与靶基因mRNA的互补碱基序列配对结合，促进其降解或抑制基因的转录。

3 m iRNAs调节釉质发育过程

3.1 釉质发育过程中m iRNAs的表达谱

近年来，学者们通过实时定量聚合酶链式反应、m iRNAs芯片分析、高通量序列分析等手段，比较小鼠牙胚组织及发育各阶段的m iRNAs的时空性表达特点，提示在牙发育的不同阶段m iRNAs的作用。

3.1.1 釉质发育过程中m iRNAs的空间性表达谱 基于牙釉质唇侧分布及终身生长的特点，小鼠的切牙结构良好地展示了釉质发育过程的各个阶段，包括细胞增殖、细胞成釉向分化及基质分泌和矿化过程。由此，通过原位分离切牙不同部位的组织（唇侧颈环、舌侧颈环、成釉系细胞区），分别提取RNA进行芯片分析，构建了釉质发育过程中m iRNAs的空间表达谱[5-6,26]。研究发现唇侧和舌侧颈环区相比较有26种差异性表达的miRNAs，唇侧颈环和成釉系细胞区相比有35种差异性表达的miRNAs。其中，实时定量聚合酶链式反应技术确认了m iR-31在唇侧颈环区表达显著高于舌侧颈环区，而m iR-138在成釉系细胞区表达明显高于唇侧颈环区。m iRNAs表达谱的建立提示了特异性的m iRNAs参与了牙上皮前体细胞的增殖更新及成釉向分化过程[5]。

3.1.2 釉质发育过程中miRNAs的时间性表达谱 学者[27]通过收集小鼠不同发育时期的牙胚组织行miRNAs芯片分析，发现牙胚发育早期的蕾状牙胚中Drosha酶和Dicer1酶的表达水平显著高于牙胚牙冠形成时期，同样的颈环干细胞区的Drosha酶和Dicer1酶的表达水平显著高于成釉系细胞区，提示m iRNAs在釉质发育过程中发挥RNA干扰的作用。M ichon[28]证实了在E16牙胚主要表达m iR-140、m iR-875-5p、m iR-31和miR-141，而E18牙胚主要表达m iR-689、m iR-455、m iR-720和miR-711。某些特异性表达的m iRNAs被进一步研究，如miR-135a在蕾状期和帽状期牙胚高表达，在内釉上皮层不表达；m iR-689在成釉器高表达，随分化进入晚钟状期E18后移行进入釉结区域[29]。

3.2 m iRNAs在釉质发育过程中的动物学研究

3.2.1 牙上皮条件性敲除m iRNAs的转基因小鼠模型 由于Dicer1是成熟m iRNA形成过程中不可或缺的物质，体内条件性敲除Dicer1构建的Cre/Dicer1flox/flox的小鼠模型，实现了特定时间在小鼠体内特定组织中敲除m iRNAs的表达，被广泛用于m iRNAs时空性表达特点和作用机制的研究。口腔上皮组织特异性表达的基因主要有Pitx2、K14和Shh，其中Pitx2和Shh在胚胎早期E10.5即被检测出局限性的表达在口腔上皮组织中[30-31]，而口腔上皮中K14的表达在E12被检测到[32]。学者们[9,33-34]通过构建Pitx2-Cre/Dicer1flox/flox转基因小鼠、K14-Cre/Dicer1flox/flox转基因小鼠和Shh-Cre/Dicer1flox/flox转基因小鼠，均实现了在口腔上皮中条件性敲除m iRNAs，以便于研究m iRNAs在釉质发育过程中的作用。

正常野生型小鼠（w ild-type m ice，WT m ice）的切牙为弯刀样，牙釉质呈黄棕色。Cao等[33]构建的Pitx2-Cre/Dicer1flox/flox小鼠切牙出现釉质发育的障碍，表现为切牙形态平直、牙釉质菲薄呈白垩色。胚胎期小鼠切牙牙胚的组织学检测发现，E14.5时牙胚形态异常且上皮细胞失去正常细胞极性，釉原蛋白和成釉蛋白的分泌显著减少，细胞的成釉向分化进程受到干扰。K14-Cre/Dicer1flox/flox小鼠[9]未出现明显的胚胎期釉质发育的障碍，然而在P5出现了异常的上皮结构的内陷，到了P25至P90，切牙釉质表面出现纵沟和点状裂隙，提示成釉上皮细胞的异常增殖活性。小鼠磨牙则形成了异常的牙尖结构，提示牙尖形态发育相关的釉结处m iRNAs可能的调控作用。小鼠切牙和磨牙的釉质均呈现不规则的表面，提示m iRNAs的缺失影响釉质形成的矿化成熟阶段。Shh是牙发育过程中介导上皮细胞间及上皮间充质细胞间相互作用的关键基因[35]，Shh-Cre/Dicer1flox/flox小鼠的上颌出现多生牙，而磨牙和下颌切牙的表型无明显异常[34]。这提示在利用Cre-loxP系统构建转基因小鼠的技术中，不同的组织特异性的基因介导的Cre小鼠会呈现不同的表型，这与基因在组织中的调控作用有密切的关系，因此选择合适的组织特异性的基因是构建Cre-loxP转基因小鼠的重要研究内容。

3.2.2 专一m iRNAs敲除的转基因小鼠模型 尽管条件性敲除Dicer1的转基因小鼠证明了m iRNAs在釉质发育过程中发挥了重要的作用，然而没有特异性的揭示某个/簇m iRNA的作用。2007年开始有学者[36]致力于利用Cre-loxP系统构建单个/簇m iRNA敲除的转基因小鼠模型，为m iRNAs特异性功能的研究提供了技术支持。越来越多的m iRNA敲除的动物模型用于生物发育和疾病发生的研究，然而釉质发育过程中特异性m iRNA敲除的研究十分有限[37]。Cao等[26]构建了全身性敲除m iR-200c/141（m iR-200c/141-/-）的转基因小鼠，发现小鼠切牙的釉质缺失、牙本质菲薄，且骨密度显著下降。组织学检测发现切牙唇侧颈环失去了细胞间连接，分泌期成釉细胞分泌的釉质基质减少，釉质矿化程度降低。以上结果证明了m iR-200c/141对于牙上皮干细胞的分化和釉质的形成具有重要的调控作用。

3.2.3 体内注射m iRNA抑制剂的小鼠模型 Antagom irs是一类在体外化学合成的m iRNAs抑制剂，根据m iRNAs的序列，经过胆固醇结合和末端修饰等技术，实现了在动物体内抑制某m iRNA的表达。首例动物体内静脉注射miR-122 Antagomir的动物模型中，Antagom ir成功地抑制了体内m iR-122的表达，降低了血浆中胆固醇的含量，从而证明了此类技术的有效性[38]。

随着该类产品的成熟和技术的发展，此类研究也应用于釉质发育过程的研究。Sehic等[39]在新生小鼠下颌磨牙区微量注射m iR-214 Antagom ir，发现实验小鼠牙釉质呈现矿化不良的表型，表现为釉柱晶体交错紊乱，釉质表面抗酸蚀能力下降。分子生物学检测釉质发育相关基因如Enam、Amelx、Calb1和Prnp等表达下降。以上结果均证实了m iR-122在釉质发育过程中的调控作用。

4 m iRNAs调控参与的信号网络

众所周知，牙发育的形态学分期包括蕾状期、帽状期、钟状期。bite-it数据库（http://bite-it.helsinki. fi）总结了牙发育各时期的信号因子表达谱，证明复杂的信号转导通路和信号反馈系统构成了精密的信号网络，以保证各项生物学事件的正常进程[40]。m iRNAs的作用原理是通过特异性地结合在靶基因的3’UTR区域，从而在转录后水平调节靶基因的表达。作为表观遗传学调控的重要内容，m iRNAs也参与到整个信号网络体系中，通过调节关键信号分子的表达调节釉质发育的过程。

4.1 成釉细胞分化过程的调控

钟状期牙胚开始进入快速分化阶段，其中成釉器分化形成牙釉质，牙乳头分化形成牙本质和牙髓，牙囊分化形成牙周组织。在此环境中，大量的信号蛋白自分泌或旁分泌作用于靶细胞，调控细胞的分化和基质的分泌过程，主要包括骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、成纤维细胞生长因子（fibroblast grow th factor，FGF）、Shh和Wnt信号通路[41-42]。m iRTooth数据库收纳了三大m iRNAs靶基因预测数据库，包括TargetScan、m iRBase和miRNAMap，釉质发育过程中这些信号蛋白的表达受到多种miRNAs的调控。

学者们进一步在釉质发育障碍的动物模型中证明了m iRNAs对下游信号因子的调控作用。Pitx2-Cre/Dicer1flox/flox小鼠经过基因组DNA芯片分析，发现m iRNAs敲除后小鼠牙胚中Noggin和Follistatin信号表达显著升高，而AMELX和AMBN基因表达下降[33]。miR-200c/141-/-转基因小鼠的前分泌/分泌期成釉细胞中Noggin表达也显著上升，而细胞连接蛋白E-cad和牙釉质基质蛋白AMELX表达下降[26]。前成釉细胞中Pitx2信号激活m iRNA-200a-3p，并且负反馈调节Pitx2和β-catenin的表达，而Pitx2/m iRNA-200a-3p信号可以通过调节Wnt/β-catenin信号通路使间充质细胞向牙上皮样细胞转化。

4.2 颈环区上皮干/前体细胞增殖的调控

颈环区上皮干/前体细胞的增殖和自我更新依赖于复杂的信号网络的调控。间充质组织中表达的Fgf信号（尤其是Fgf3和Fgf10）作为激动剂，可以旁分泌调节上皮中的Notch信号通路的表达[43-44]。体内下调Fgf抑制剂Spry-2和Spry-3能有效促进上皮干细胞的增殖活性[45]。另外，研究[46]证明BMP信号通路参与抑制颈环处干细胞的增殖，而BMP抑制剂Noggin能促进切牙的持续性生长。m iRTooth数据库根据生物信息学分析预测Fgf10是m iR-31的靶基因，Spry-2是miR-720和miR-652的靶基因，Noggin是miR-200b、m iR-200c和m iR-429的靶基因，提示m iRNAs在切牙干/前体细胞更新和增殖过程中的作用。

内源性的activin信号特异性地表达在唇侧间充质组织中，其异常激活会导致颈环过度增殖形成多生牙胚，并且通过抑制唇侧颈环区Bmp4和Fgf3的表达促进干细胞的增殖。此表型与K14-Cre/Dicer1flox/flox小鼠牙釉质纵沟的形成可能有相似的调控机制。另外，Pitx2-Cre/Dicer1flox/flox小鼠[33]因体内miRNAs的上皮条件性敲除，亦呈现颈环区结构的膨大，形成多生切牙。这提示m iRNAs可能通过调节唇侧间充质中activin的表达调控干/前体细胞的增殖能力，然而特异性调控的m iRNA和直接的调控证据仍需进一步的研究。

4.3 牙尖形成过程的调控

牙釉质的形成过程与牙冠的形态发生密切相关，目前认为牙尖的形态和数量与牙胚釉结的发育有密切的关系。帽状期的初级釉结和钟状期的次级釉结是内釉上皮局部增厚形成的，许多与胚胎发育相关的关键基因在釉结中都有表达，从而使釉结成为调节牙早期形态发生的重要结构。如Bmp2、Bmp4通过刺激homeobox转录因子调节牙胚早期发育，Bmp6调节上皮-间充质的相互作用[47]。Shh信号在釉结的表达可能与釉结细胞的凋亡有关，并通过调控Fgf4的表达调节细胞增殖和参与牙冠形态发生[48]。miRNAs在釉结中的表达无直接的证据证明，一些研究的间接证据提示m iRNAs在釉结信号网络中的作用。研究[9]证明m iR-689的靶基因axin2在E18之前高表达。K14-Cre/Dicer1flox/flox小鼠多生牙尖的表型与Sostdc-1-/-小鼠、Spry2-/-小鼠和K 14-Eda转基因小鼠的表型类似[32,49-50]。由此，更多的m iRNAs参与牙冠发育形成的研究仍需进一步的探索。

5 总结和展望

通过互补性结合靶基因mRNA的3’UTR，miRNAs在转录后水平调节基因的表达，参与调节釉质发育过程。高通量数据筛选的技术构建了m iRNAs在釉质发育过程中的时空性表达谱。miRNAs条件性敲除的转基因小鼠及专一m iRNAs敲除的转基因小鼠为揭示m iRNAs的调节作用提供了更直接的证据，然而特定的某个/簇miRNAs的调控作用仍然研究较少，可能与单个/簇miRNAs干扰的技术局限有关。另外化学制剂Agomir、Antagom ir在动物模型中的运用，为miRNAs的体内研究拓宽了思路，有赖于更可靠的体外合成技术的进展，例如增加试剂的靶向性、稳定性、可追踪性等。

m iRNAs参与釉质发育过程中复杂的信号网络调节体系，与Bmp、Wnt、Shh等信号通路密切相关，参与细胞分化、干细胞增殖及秞结发育等各个阶段。虽然大量的数据支持m iRNAs在网络调控中的功能性作用，然而miRNAs靶向作用的机制仍有待于大数据库的筛选和更多直接的动物学证据证明。

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（本文编辑 李彩）

Expression and function of m icroRNAs in enamel development

Zhou Yachuan, Zhou Xuedong, Zheng Liwei. (State Key Laboratory of Oral Diseases, National Clinical Research Center for Oral Diseases, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, China)

m icroRNAs (m iRNAs) are endogenous short, noncoding RNAs that can negatively regulate gene expression post-transcriptionally. m iRNAs are involved in multiple developmental events in various tissues and organs, including dental enamel development. Any disruption during enamel development may result in inherited enamel malformations. This article reviews the expression and function of m iRNAs in enamel development.

m icroRNAs; enamel development; ameloblast; expression

R 780.2

A

10.7518/hxkq.2017.03.018

Supported by: The National Natural Science Foundation of China (81470711, 81371136). Correspondence: Zheng Liwei, E-mail: liwei.zheng@scu.edu.cn.

2016-08-11；

2016-12-09

国家自然科学基金（81470711，81371136）

周雅川，博士，E-mail：iamyczhou@outlook.com

郑黎薇，教授，博士，E-mail：liwei.zheng@scu.edu.cn