倪艳波 张立霞 崔大鹏 张妍霞 赵 敏 杨 静 李 琳

(滨州医学院，山东 烟台 264003)

灰树花多糖对人肺腺癌细胞株A549线粒体的影响

倪艳波 张立霞 崔大鹏 张妍霞 赵 敏 杨 静 李 琳

(滨州医学院，山东 烟台 264003)

目的 检测人肺癌细胞株A549的细胞增殖、线粒体呼吸水平及线粒体膜电位，观察灰树花多糖对A549线粒体的影响。方法 CCK-8法检测A549细胞增殖，线粒体呼吸系统检测细胞线粒体呼吸水平，MitoTracker Red CMXRosb线粒体荧光探针、罗丹明123(Rh123)检测线粒体膜电位。结果 CCK-8检测细胞增殖显示0.4%的灰树花多糖即可抑制A549细胞的增殖，0.6%灰树花多糖作用4 h 后，绝大多数A549细胞死亡，其结果与对照组相比较有显著差异(P<0.05)；线粒体呼吸系统结果显示，0.4%灰树花多糖作用于A549细胞4 h 后细胞呼吸微弱；荧光显微镜观察细胞状态、线粒体荧光探针染色显示，0.4%、0.6%灰树花多糖组部分细胞凋亡，细胞收缩呈圆形，强荧光表达；流式细胞仪检测线粒体膜电位显示，0.4%、0.6%灰树花多糖组荧光信号增强。结论 灰树花多糖可以抑制A549的增殖，其作用机制与线粒体膜电位的耗散相关。

灰树花多糖；A549；线粒体

A549细胞系是人肺腺癌细胞系，是研究肺癌与肺纤维化的常用细胞系，以转化生长因子(TGF)-β1诱导A549细胞出现上皮细胞-间质细胞转化是肺纤维化体外研究的常用方法〔1，2〕。本研究观察灰树花多糖对A549细胞转化的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞、药品及仪器 肺腺癌细胞株A549，购自中科院上海细胞库。灰树花多糖，浙江方格药业有限公司，纯度50%；线粒体荧光探针，MitoTracker Red CMXRosb，美国Invitrogen公司；罗丹明123(Rh123)，南京凯基生物科技有限公司；凯基新型四唑单钠盐法检测试剂盒，南京凯基生物科技有限公司。IX71倒置荧光显微镜，奥林巴斯株式会社；流式细胞仪，贝克曼库尔特XL；全波段酶标仪，美国Molecular Devices；线粒体呼吸系统Oxygraph-2k，奥地利Oroboros。

1.2 实验方法

1.2.1 灰树花多糖溶液配制 将1 g灰树花多糖加至50 ml生理盐水中，用300目滤网过滤一遍，高压消毒备用。

1.2.2 实验分组 0.2%，0.4%，0.6%灰树花多糖组：分别将10、20、30 μl配制好的灰树花多糖溶液加入完全培养基(高糖DMEM+10%胎牛血清)至100 μl。以完全培养基正常培养组为对照组。

1.2.3 细胞增殖检测 将100 μl A549细胞加入96孔板中，培养24 h后至倒置显微镜上观察细胞状态，将原培养基吸出，各组分别加入10、20、30 μl灰树花多糖溶液及完全培养基，放回CO2培养箱中培养4 h，向每孔加入10 μl CCK-8试剂，孵育4 h，至全波段酶标仪测定在450 nm处的吸光度。

1.2.4 线粒体呼吸系统检测 A549细胞接种至培养瓶中，培养细胞至85%铺满培养瓶底，以0.4%的浓度加灰树花多糖作用4 h，以完全培养基为对照组，收取细胞，离心，PBS洗一次，两组分别取200 μl细胞加入已经平衡好的线粒体呼吸系统检测A、B池内，检测细胞线粒体呼吸水平。

1.2.5 MitoTracker Red CMXRosb检测 将100 μl A549细胞爬片，培养24 h后，以0.2%，0.4%，0.6%的浓度加灰树花多糖，完全培养基作对照，放回CO2培养箱中培养4 h，向每孔加入MitoTracker Red CMXRosb 10 μl，孵育30 min后至倒置荧光显微镜下观察。

1.2.6 流式细胞仪检测线粒体膜电位 A549细胞种至6孔板中，培养细胞至近80%铺满培养板底，以0.2%、0.4%、0.6%灰树花多糖的浓度加灰树花多糖，完全培养基作对照，加入Rh123(5 μg/ml，1 ml)孵育10 min，胰酶消化，收集细胞，离心去上清，加PBS冲洗一遍，流式细胞仪上机检测。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件进行析因分析。

2 结 果

2.1 A549细胞增殖情况 与对照组(1.12±0.33)相比较，0.2%灰树花多糖组细胞增殖(0.98±0.306)差异无统计学意义(P>0.05)，0.4%灰树花多糖组细胞增殖(0.816±0.16)差异显著(0.01

2.2 A549细胞线粒体呼吸水平 线粒体呼吸系统显示，0.4%灰树花多糖组氧耗量平均值为48.07 pmol·s-1·ml-1，明显低于对照组氧耗量(63.5 pmol·s-1·ml-1)。

2.3 A549细胞生长状态线粒体荧光探针染色观察 加不同浓度的灰树花多糖培养4 h后至倒置显微镜下观察发现，0.2%灰树花多糖组与对照组细胞状态好，形状无改变；0.4%灰树花多糖组细胞量较对照组少，大多数细胞形状无改变，部分细胞凋亡，凋亡细胞形状收缩呈圆形；0.6%灰树花多糖组大多数细胞凋亡或死亡，贴壁细胞数少，极少数细胞保持A549细胞的原有形状。倒置荧光显微镜下观察可以发现正常细胞荧光染色均匀，可见清晰的细胞核，凋亡细胞小，呈圆形，荧光强度较正常细胞强，未见细胞核。见图1。

图1 细胞培养状态与线粒体荧光探针染色(×100)

2.4 流式细胞仪检测A549细胞膜电位 Rh123染色，流式细胞仪检测，对照组与0.2%灰树花多糖组荧光信号强度几乎相同，0.4%灰树花多糖组荧光信号强度稍强，0.6%灰树花多糖组荧光信号强度较其他组强、流式峰图明显右移。见图2。

图2 Rh123染色检测线粒体膜电位(Overlay)

3 讨 论

灰树花又名贝叶多孔菌、千佛菌、栗子蘑、云蕈等，其营养丰富，含有生物活性物质，具有独特的营养和药用价值。灰树花含有还原糖、甘露糖、葡聚糖，以葡聚糖为主〔3〕。实验研究表明，从灰树花子实体提取的多糖具有抗肿瘤作用，并有一定预防肿瘤的效果，目前对于抗肿瘤的研究主要集中在卵巢癌、乳腺癌等〔4～6〕，对于肺癌的研究相对较少。本研究用CCK-8法研究灰树花多糖对人肺腺癌细胞A549细胞增殖的影响，发现较大剂量的灰树花多糖可以抑制A549细胞的增殖，甚至造成A549细胞的大量凋亡及死亡。CCK-8法检测细胞增殖是一种较以前常用研究细胞增殖的方法MTT操作简便，稳定性、重复性更高的检测方法〔7〕。线粒体呼吸系统又称高分辨呼吸测定系统，可以对培养细胞、人体组织等进行呼吸测定。本研究0.4%灰树花多糖组与对照组取相同的细胞量进行呼吸测定，发现0.4%灰树花多糖组耗氧量低，该组细胞呼吸微弱。细胞或组织呼吸微弱可能是由细胞凋亡，线粒体或新陈代谢疾病，过氧应激等病理现象导致，结合其他实验结果，考虑细胞呼吸水平的减弱与灰树花多糖促进A549细胞的细胞凋亡相关，细胞凋亡与线粒体膜电位的耗散具有密切的相关性。MitoTrackers Red选择性聚集在线粒体，与线粒体内的蛋白质生成稳定的生物共轭体，实现对线粒体的稳定的荧光染色，其积累取决于膜电位，是常用的线粒体检测染料之一〔8〕。Rh123是一种可透过细胞膜的阳离子荧光染料，是一种线粒体跨膜电位的指示剂〔9〕。本研究提示灰树花多糖会影响A549细胞的体外增殖，其作用与线粒体膜电位的耗散相关。

1 黄珍姐，郑金旭，汤 艳，等.肺泡上皮细胞间质转化及其信号转导途径在肺纤维化中的作用〔J〕.临床肺科杂志，2011；16(6)：823-6.

2 黄 敏，杨惠芳，陈 楠，等.百草枯诱导A549细胞间质转化及四氢吡咯二硫化氨基甲酸酯的干预作用〔J〕.工业卫生与职业病，2013；39(6)：321-7.

3 李 磊，王卫国，郭彦亮，等.灰树花多糖的制备与其生物活性研究进展〔J〕.食品工业科技,2009;30(11)：327-31.

4 Soares R，Meireles M，Rocha A，etal.Maitake(D fraction) mushroom extract induces apoptosis in breast cancer cells by BAK-1 gene activation〔J〕.J Med Food，2011;14(6)：563-72.

5 Jiang J，Sliva D.Novel medicinal mushroom blend suppresses growth and invasiveness of human breast cancer cells〔J〕.Int J Oncol，2010;37(6)：1529-36.

6 Martin KR，Brophy SK.Commonly consumed and specialty dietary mushroomsreduce cellular proliferation in MCF-7 human breast cancer cells〔J〕.Exp Biol Med(Maywood)，2010;235(11)：1306-14.

7 熊建文，肖 化，张镇西.MTT 法和CCK-8法检测细胞活性之测试条件比较〔J〕.激光生物学报，2007;16(5)：559-62.

8 葛杨杨，谷 庆，马长生，等.MLN2238对宫颈癌HeLa细胞生长抑制和放射增敏及其机制探讨〔J〕.中华肿瘤防治杂志，2014;21(4)：246-51.

9 Blattner JR，He L，Lemasters JJ.Screening assays for the mitochondrial permeability transition using a fluorescence multiwell plate reader〔J〕.Anal Biochem，2001；295(2)：220-6.

〔2015-09-01修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

山东省自然科学基金项目(ZR2013HL002)；烟台市科技发展计划项目(2012129)；滨州医学院科技重点计划(BY2013KJZD04，BY2012KJZD10)

张立霞(1981-)，女，硕士，高级实验师，主要从事食用菌多糖实验研究。

倪艳波(1979-)，男，硕士，讲师，主要从事灰树花多糖药理作用研究。

R965.1

A

1005-9202(2017)03-0542-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.03.009