健脑益智胶囊不同纯化工艺对脑缺血再灌注模型大鼠脑组织炎症反应的影响

2017-02-28郭东艳赵晓平覃鸿恩

中国老年学杂志 2017年3期

关键词：健脑益智脑缺血

郭东艳范妤赵晓平覃鸿恩

(陕西中医学院，陕西咸阳 712046)

健脑益智胶囊不同纯化工艺对脑缺血再灌注模型大鼠脑组织炎症反应的影响

郭东艳范妤赵晓平1覃鸿恩

(陕西中医学院，陕西咸阳 712046)

目的研究不同纯化工艺制备的健脑益智胶囊对脑缺血再灌注损伤大鼠炎症反应和神经元凋亡的影响。方法 120只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、原药液组、醇沉组、壳聚糖组、膜分离组，给药组提前给药1 w(给药剂量按健脑益智胶囊内容物为0.6 g·100 g-1·d-1，给药体积为1 ml·100 g-1·d-1)。建立大脑中动脉缺血(MCAO)再灌注损伤模型，尼氏染色后观察大鼠缺血侧大脑皮质神经元形态变化；检测缺血侧脑组织白细胞介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子(TNF)-α和细胞间黏附分子(ICAM)-1的含量；免疫组化法检测脑组织中凋亡相关蛋白Fas、FasL的表达。结果不同纯化工艺制备的健脑益智胶囊均能保护神经元结构，减轻神经元损伤，显著降低脑组织中IL-1β、TNF-α和ICAM-1的含量，下调 Fas、FasL蛋白的表达，其中醇沉组改善作用更为明显。结论健脑益智胶囊通过抑制炎症反应，阻断神经细胞凋亡，实现神经保护组作用。

健脑益智胶囊；脑缺血再灌注损伤；炎症因子；凋亡

健脑益智胶囊由水蛭、葛根、郁金、石菖蒲、白茅根等药味组成，具有豁痰开窍、活血化瘀、通脉益智的功效，临床上主要用于预防和治疗外部颅脑损伤、缺血性脑损伤、脑震荡及脑水肿等脑部疾病〔1～4〕。为了提高健脑益智胶囊质量，降低临床服药量，本实验拟在前期提取工艺研究的基础上〔5〕，考察不同纯化工艺制备的健脑益智胶囊对大鼠脑缺血再灌注模型炎症反应的影响。

1 材料与方法

1.1 药品葛根(批号：121101；产地：广西)、白茅根(批号：130401 ；产地：陕西)、郁金(批号：130101；产地：广西)、石菖蒲(批号：130401 ；产地：四川)，以上饮片均购自西安盛兴中药饮片有限责任公司，经陕西中医学院王继涛老师鉴定，分别为葛根为葛根豆科植物野葛(Willd.)的干燥根，白茅根为禾本科植物白茅(Nees)的干燥根茎，郁金为姜科植物温郁金的干燥块根，石菖蒲为天南星科植物石菖蒲的干燥根茎；葛根素对照品(供含量测定用，批号：110752-201313)来源于中国食品药品检定研究院；壳聚糖(69047438，生化试剂BR，国药集团化学试剂有限公司)。甲醇、乙腈均为色谱纯，水为超纯水，其他试剂为分析纯。

1.2 仪器 UV-2550紫外可见分光光度计(日本岛津)，L-520型离心机(湖南赛特湘仪离心机有限公司)，恒温水浴锅(HH-2型，北京科伟永兴仪器有限公司)，梅特勒电子天平(GB204 瑞士)，生物显微镜(Leica DM4000B，德国徕卡公司)，GQ76管式离心机(上海市离心机械研究所有限公司)，PFT-A500电子天平(福州华志科学仪器有限公司)。

1.3 实验试剂白细胞介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子(TNF)-α和细胞间黏附分子(ICAM)-1试剂盒均购于南京建成生物工程研究所；Fas、FasL一抗、SABC试剂盒均购于武汉博士德生物工程有限公司。

1.4 实验动物雄性SD大鼠120只，体重300～350 g，饲养环境为SPF级，购于西安交通大学动物实验中心，动物合格证号：SCXK(陕)2013-003。

1.5 方法

1.5.1 不同纯化工艺健脑益智胶囊的制备按处方比例称取白茅根、葛根、郁金和石菖蒲，其中郁金、石菖蒲两味药材加入10倍量的水，浸泡2 h，提取挥发油6 h，收集挥发油和水溶液备用；药渣与白茅根、葛根两味加入10倍量水，煎煮2次，每次2 h，水煎液和蒸馏后的水溶液合并，过滤，即得水提液。将水提液分成4等份，一份备用，其余3份进行醇沉〔6〕、壳聚糖〔7〕和膜分离〔8〕三种工艺处理，另将挥发油分成四等份，分别加入原水提液及三种不同精制工艺后的溶液中，混匀。按处方比例称取水蛭，分成两份，一份粉碎，过40目筛，用60%乙醇回流提取1 h，提取2次，滤过，滤液浓缩至无醇味，分成4等份，分别加入上述四种溶液中，混匀；取另一份水蛭，粉碎，过100目筛，分成4等份，分别加入上述四种溶液中，混匀、干燥、粉碎、填充、即得不同纯化工艺制备的健脑益智胶囊。

1.5.2 动物分组与给药 120只大鼠随机分成6组，即假手术组、模型组、原药液组、醇沉组、壳聚糖组、膜分离组，每组20只。给药组提前给药1 w，给药剂量按健脑益智胶囊内容物为0.6 g·100 g-1·d-1，给药体积为1 ml·100 g-1·d-1。

1.5.3 大鼠脑缺血再灌注损伤模型的制备将经1.5.2方法处理后的大鼠提前禁食12 h，照常给水。参照Zea Longa改良法建立左侧大脑中动脉缺血(MCAO)模型：大鼠称重后腹腔注射10% 水合氯醛 3 ml/kg麻醉，于颈部偏右侧切口，分离右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)，结扎右CCA近心端、ECA及其分支动脉。分离右侧ICA，沿ICA向下分离翼颚动脉，根部结扎该动脉分支。在CCA近心端备线，另一端加动脉夹，在距离颈动脉分叉0.5 cm处剪开一小口，将处理后的渔线经ECA插入ICA进入大脑中动脉分支处，以阻断大脑中动脉所有血流来源。缺血1.5 h后，拔出渔线，再灌注48 h。假手术组只做动脉分离暴露，不插拴线，其余步骤相同。手术过程中大鼠保持体温在37℃左右。

1.5.4 尼氏染色检测脑组织病理学变化大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，快速断头取出大脑，置于10%甲醛溶液中固定，包埋切片，脱蜡至水后，0.1%甲苯胺蓝染色10 min，脱水、透明、封片，显微镜下观察并拍照，观察神经元胞体内尼氏体变化。正常细胞不同程度的含有尼氏体，经甲苯胺蓝染色后呈蓝色，细胞凋亡后，细胞质内尼氏体减少甚至消失。

1.5.5 ELISA法检测大鼠脑组织中IL-1β、TNF-α和ICAM-1的含量取备用血清，严格按照 ELISA 试剂盒说明操作，测定 450 nm吸光度值，制定标准曲线。标准及检测标本均采用复孔，复孔测定的吸光度值取均数减去零标准孔吸光度值的均数作为该浓度标准浓度或检测标本的测定值，进一步通过标准曲线和稀释倍数计算出浓度。

1.5.6 免疫组化法检测缺血侧脑组织Fas、FasL表达水平大鼠灌流固定后，取缺血侧脑组织,常规固定、脱水、石蜡包埋后，制作标本切片，采用免疫组化SABC法染色,DAB显色，光镜(×400)下观察阳性细胞个数。每张切片随机取大脑皮质5个不重叠视野计数阳性细胞，计数不分细胞种类。

1.6 统计学方法采用SPSS13.0软件进行单因素方差分析。

2 结果

2.1 不同纯化工艺健脑益智胶囊对脑缺血再灌注后大鼠脑组织病理变化的影响缺血侧大脑皮质尼氏染色后光学显微镜下观察神经元胞体内尼氏体变化，结果显示：假手术组神经元胞体内尼氏体清晰可辨，呈紫蓝色斑块状，数量多，体积大；模型组尼氏体明显减少呈细颗粒状，染色浅，部分神经元内尼氏体消失；与模型组比较，不同纯化工艺制备的健脑益智胶囊预处理组尼氏体明显增多，体积增大，紫蓝色染色清晰。膜分离组尼氏体数量较少。见图1。

图1 各组大鼠脑组织尼氏染色(甲苯胺，×200)

2.2 不同纯化工艺健脑益智胶囊对脑缺血再灌注大鼠脑组织IL-1β、IL-6和ICAM-1的影响脑缺血再灌注48 h后脑组织中IL-1β、TNF-α和ICAM-1水平均显著升高(P<0.01)，健脑益智胶囊不同纯化工艺组均能降低脑组织中IL-1β、TNF-α和ICAM-1的表达(P<0.05)，其中，醇沉组对IL-1β和TNF-α的表达抑制作用更为明显(P<0.01)。见表1。

2.3 不同纯化工艺健脑益智胶囊对脑缺血再灌注大鼠脑组织Fas、FasL表达的影响与假手术组比较，模型组Fas、FasL蛋白表达水平明显增加(P<0.01)；与模型组比较，健脑益智胶囊不同纯化工艺组均能减低Fas、FasL蛋白的表达(P<0.05)。见表2。图2。

表1 健脑益智胶囊对脑缺血再灌注大鼠脑组织IL-1β、 TNF-α和ICAM-1的影响

与假手术组比较:1)P<0.01；与模型组比较:2)P<0.05，3)P<0.01

表2 健脑益智胶囊对脑缺血再灌注大鼠脑组织Fas、 FasL表达的影响

与假手术组比较：1)P<0.01；与模型组比较:2)P<0.01

图2 大鼠大脑皮质中Fas的阳性表达(×400)

3 讨论

脑缺血及再灌注损伤的病理生理机制复杂，目前认为存在多种机制相互作用形成的复杂调控网络，包括炎症损害、自由基损伤、氧化应激、兴奋性氨基酸毒性、细胞内钙超载等，直接或间接导致神经细胞凋亡或死亡，导致神经功能障碍。大量研究表明炎症反应与脑缺血再灌注损伤关系密切。在炎症反应中，有许多炎性因子参与，IL-1和TNF-α是由单核/巨噬细胞产生的单核因子〔9〕。IL-1可以协助白细胞迁移和刺激内皮细胞的各种反应,通过激活血管内皮细胞而增强内皮细胞黏附分子(ECAM)表达,增强白细胞与内皮细胞的黏附，破坏血脑屏障的通透性，加重脑组织损伤；同时TNF-α与细胞膜上的死亡受体结合细胞膜死亡受体结合，激活Fas/FasL凋亡蛋白，导致细胞凋亡〔10，11〕。本实验结果显示：健脑益智胶囊不同纯化工艺组均能降低脑缺血再灌注大鼠脑组织中炎性细胞因子IL-1、TNF-α和ICAM-1的含量，下调凋亡蛋白Fas/FasL的表达，说明健脑益智胶囊通过降低炎性因子与黏附分子的含量抑制炎症反应，阻断神经细胞凋亡，实现脑缺血再灌注后的神经保护功能。

1 张宝丽，范小璇，赵晓平.健脑益智胶囊对基底节区脑出血术后的疗效观察〔J〕.陕西中医学院学报，2007；30(5):10-1.

2 范小璇，赵晓平，梁格婷.健脑益智胶囊对外伤性脑出血患者IgG-CSF的影响〔J〕.中国中医急症，2011；20(10):1552-4.

3 周振国，范小璇，赵晓平，等.健脑益智胶囊对颅脑损伤大鼠血浆 NPY 含量的影响〔J〕.现代中西医结合杂志，2012；21(31):3437-9.

4 畅涛，赵晓平，周振国.健脑益智胶囊治疗脑震荡疗效观察〔J〕.辽宁中医药大学学报，2008；10(11):120-1.

5 赵晓平，吕杨，范小璇，等.健脑益智胶囊提取工艺研究〔J〕.陕西中医学院学报，2013；36(5):83-5.

6 郭东艳，覃鸿恩，赵晓平，等.健脑益智胶囊水提部位精制工艺研究〔J〕.陕西中医学院学报，2014；37(5)：66-9.

7 杨伟平，郭东艳，覃鸿恩，等.壳聚糖澄清剂对健脑益智胶囊水提部位的纯化工艺研究〔J〕.现代中医药，2014;34(6)：70-2.

8 郭东艳，覃鸿恩，赵晓平，等.ZrO2无机陶瓷膜微滤技术精制健脑益智胶囊水提部位的研究〔J〕.现代中医药，2014；34(5)：69-72.

9 袁立霞.当归拈痛汤对类风湿性关节炎作用机理及配伍的实验研究〔D〕.哈尔滨：黑龙江中医药大学，2006.

10 王军，张红霞，贾士奇，等.生姜对全脑缺血再灌注大鼠脑组织炎性细胞因子和黏附分子含量的影响〔J〕.医药论坛杂志,2011；32(15):12-4,18.

11 刘永刚,李芳君,王婧,等.银杏内酯B对大鼠脑缺血-再灌注损伤炎症反应的影响〔J〕.中药材，2010；33(4)：578-80.

〔2015-08-28修回〕