刘 燕 荀来武* 郑锦玲 冯 刚 彭 洁（云南农业职业技术学院 云南 昆明 650212 玉溪农业职业技术学院 云南 玉溪）

一株鹅源新城疫病毒分子特征和遗传发生分析

刘 燕①荀来武*①郑锦玲①冯 刚②彭 洁①（①云南农业职业技术学院 云南 昆明 650212 ②玉溪农业职业技术学院 云南 玉溪）

经对2007年从昆明某鹅场疑似新城疫发病鹅体内得到的病原进行分离鉴定，结果表明中国部分地区鹅群中已存在对鹅和鸡等禽类具有较强致病性的NDV。该毒株经毒力(MDT)检测为强毒株，鸡胚平均死亡时间为48～60h。RTPCR扩增出了融合蛋白(F)基因，测定相应的核苷酸序列并进行遗传发生分析和酶切位点分析，对基因编码的氨基酸序列进行了推导，试验毒株的蛋白酶裂解激活位点附近的氨基酸序列为112R(K)RQKR↓F117，为强毒特征序列。根据绘制的系统进化发生树和F基因上限制性内切酶(RE)位点分布，确定了这个毒株为基因Ⅶ型。以上证据表明该基因型的新城疫病毒在我国鹅群的流行占据一定的优势。

鹅 新城疫病毒 遗传发生树

新城疫(Newcastle disease，ND)是禽类的一种高度接触性、烈性传染病，曾多次造成世界范围的大流行，给养禽业带来巨大的经济损失[1]。自1997年以来，鹅新城疫

(鹅副粘病毒病)在我国许多地区鹅群中暴发[2,3]，由于采取了各种防疫措施，疫情得到了一定的控制，但仍有发生。据研究报道，引起鹅群发病的新城疫病毒毒株在生物学特性、毒力及基因型上与同时期引起鸡群发病的新城疫病毒毒株没有显著差异[4,5]。笔者对2007年下半年分离到的新城疫病毒毒株的F基因进行研究，以期望了解目前鹅群中NDV的变异情况，为制定控制鹅群中新城疫的发生提供防制依据。

1 材料和方法

1.1 病毒和其他生物材料 NDV毒株由2007年发病鹅群中分离，命名为KM2007株。SPF鸡胚购自云南省禽病研究中心SPF鸡场。

1.2 主要试剂 禽白血病病毒反转录酶(AMV)、Taq DNA聚合酶、pGEM-T Easy Vector、感受态大肠杆菌等分别购自Roche公司和Promega公司。其他试剂均为国产分析纯化学试剂。

1.3 引物 参照已发表的NDV毒株基因的核苷酸序列设计2对引物，P1和P2用于扩增M基因1161nt至F基因889nt间长约970pb的片段，P3和P4用于扩增F基因862nt至F基因1700nt间长约839bp的片段[4]。引物由上海生物工程技术服务有限公司合成，序列为：P1 5′-GCCGAATTCCCG AATCATCACGACGCTTAA-3′，P2 5′-GTGAAGCTTGA GTCTGTGAGTCGTAC-3′，P3 5′-CACCGGTACCCCTAT TCTGATCG-3′，P4 5′-TTAAGCTTGTAGTGGCTCTCAT CTGATC-3′。

1.4 病毒毒力的测定 按照国际兽疫局(OIE)介绍的方法进行。

1.5 NDVF基因 NDV毒株的RNA抽提和F基因RT-PCR扩增按照吴艳清等[6]所报道的方法进行。RT-PCR扩增产物直接克隆到pGEM-T Easy Vector，转化感受态大肠杆菌，筛选阳性克隆。

1.6 NDV F基因测定、序列分析和氨基酸序列分析 步骤1.5中筛选出的F基因阳性克隆寄送到联合基因上海联众基因研究院测定核苷酸序列，用DNA Star4.0版本软件包的各类软件(DNA STAR Inc．Madison，wI153715，USA)分析F基因的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列。

1.7 NDV系统进化发生树和限制性内切酶位点分布分析据Ballagi-Pordany等[7]报道的方法，根据F基因47～420nt之间的374bp片段的核苷酸序列绘制NDV系统进化发生树，同时分析F基因334～1682nt之间的1349bp片段上Hinf I、BstO I和Rsa I 3种RE位点分布。

2 结果

2.1 病毒毒力的测定结果 根据OIE有关NDV毒力标准，该株鹅源NDV的鸡胚死亡时间为48～60h，为强毒株。

附图 新城疫病毒系统进化发生树

2.2 NDV F基因片段的扩增、克隆 该毒株经RT-PCR扩增出了大小为970pb和839bp的特异性条带。

2.3 NDV F基因序列测定和序列分析 （1）NDV F基因序列测定和氨基酸序列推导分析：测定得到F基因全长核苷酸序列，其同源性高达98%以上。推导出相应编码氨基酸，该毒株的F基因编码由553个氨基酸组成的F蛋白前体，这种前体上分布了N末端信号肽区、蛋白酶裂解激活区、融合诱导区和C末端跨膜区等功能区，在糖基化位点和半胱氨酸分布方面高度保守。试验毒株的蛋白酶裂解激活位点附近的氨基酸序列为112R(K)RQKR↓F117，符合NDV强毒株的规律[8]。（2）NDV系统进化发生树和限制性内切酶位点分布：用DNA Star软件对该分离毒株和28个参考毒株的F基因47～420nt区域进行同源性比较，绘制了系统进化发生树(附图)。结果显示，本试验中该毒株在系统进化发生树的Ⅶ型主干分枝的1个分枝上，为基因Ⅶc亚型。（3）NDV基因型的分类最初是以F基因334～1682nt间3种RE(Hinf I、BstO I和Rsa I)位点分布的差异为依据的，后又发现以F基因47～420nt之间的核苷酸序列绘制的系统进化发生树与RE位点分布所反映的毒株间遗传关系一致，有些RE位点可作为鉴别基因型的标志。（4）本试验的NDV分离株归于Ⅶc亚型，具有特定的RE位点分布。在736、883nt具有Hinf I位点，而在1198、1350nt不具有Hinf I位点，在752、1116nt具有Hinf I位点，而在953、1478、1601nt不具有Hinf I位点。在872、973、1249nt具有Hinf I位点，而在540、683、1593、1625nt不具有Hinf I位点。

3 讨论

（1）2007年下半年笔者从发病鹅群中分离到了1株NDV，按照OIE介绍的方法对其毒力进行测定。鹅源NDV的鸡胚死亡时间为48～60h，而F蛋白裂解位点的氨基酸推导序列为l12R(K)RQKR↓F117，证实为强毒株。这说明自从1997年鹅源新城疫在我国暴发流行以来。目前该病虽然被控制，但在局部地区仍时有发生，而且强毒株在鹅群中仍然存在，在适当的情况下还会导致疫病的发生。（2）通过对该株NDV的系统进化发生树和限制性内切酶位点分布分析，发现分离到的NDV毒株属于Ⅶc亚型，并且和近年来在鹅群和鸡群中流行的NDV毒株分布在一个分支上，同源性很高，并且3种限制性内切酶的酶切位点相同，与以前报道的同一亚型毒株的限制性内切酶的酶切位点一致。这说明该毒株在鹅群和鸡群中长期存在和循环传播，而非外来病毒所致。（3）由于我国对新城疫采取的是疫苗接种为主的防制措施，而疫苗的制造、运输、保存和使用都会存在较多的问题，且多数养殖场缺少免疫监测，制订的免疫程序或多或少存在问题，免疫抑制性疾病的发生等导致预防措施达不到预期目标，因而对本病的防制仍然存在较大困难。

[1] 国际兽医局. 农业部畜牧兽医局编译. 诊断试验和疫苗标准手册第3版[M]. 北京: 中国农业科学出版社, 1996.

[2] 王永坤, 田慧芳, 周继宏等. 鹅副粘病毒病的研究[J]. 江苏农学院学报, l 998, 19(1): 59-62.

[3] 左玉柱, 乔木, 王学理等. 鹅源副粘病毒NA-1株F蛋白基因的克隆及其载体的构建[J]. 中国兽医学报, 2004. 24(5): 436-438.

[4] 吴艳涛, 倪雪霞, 万洪全等. 我国部分地区不同动物来源新城疫病毒的分子流行病学[J]. 病毒学报, 2002. 18(3): 261-269.

[5] Herczeg J. Wehmann E. Bragg R R, et a1. Two novel genetic groups (Ⅶb and Ⅶ)responsible for recent Newcastle disease outbreaks in Southern Africa, one(Ⅶb)of which reached Southern Europe[J].Arch Virol, 1999. 144: 2087-2099.

[6] 吴艳清, 刘秀梵, 张加宽. 新城疫病毒F48E8融合蛋白基因的序列分析[J]. 病毒学报, 1999, 15(2): 143-146.

[7] Ballagi-Pordany A, Wehmann E. Herczeg J, et al. Identification and groping of Newcastle disease Virus Strains by restriction site analysis of a region from the F gene[J]. Arch Virol, 1996. 141: 243-261.

[8] Toyoda T. Sakaguchi T, Imai K. et al. Structure comparison of the cleavage-activation site of the fusion glycoprotein between virulent and avirulent strains of Newcastle disease virus[J]. virology 1987, 158: 242-247.

S852.65

A

1007-1733(2017)02-0010-02

2016–10–22）

项目来源：云南省教育厅科学研究基金项目(2015Y615)

*通讯作者