金昭延

摘要：目的 检测乳腺癌患者mtDNA D-loop环HV2区体细胞性突变并探讨它在肿瘤发生中的作用。方法 采用聚合酶链反应-单链构像多态性（PCR-SSCP）的方法对20例浸润性乳腺导管癌组织和癌旁正常组织的mtDNA非编码区D-loop环HV2区进行分析，将出现异常条带所有标本进行基因测序。结果 经PCR-SSCP检测，在20例乳腺癌mtDNA中共发现7例出现异常条带；测序结果显示，7例測序标本中，HV2区共检测到31个新的突变位点，其中有3个属于微卫星不稳定性（microsatellite instability，MSI），7例移码突变，其余为点突变（point mutation），7个位点位于复制和转录的区域。结论 浸润性乳腺导管癌mtDNA HV2区是一个高度多态性和突变性的区域，它与乳腺癌的发生、发展有重要关系。

关键词：浸润性乳腺癌；mtDNA；HV2区；聚合酶链反应-单链构像多态性

Abstract：Objective To detect the effect of mutations of HV2 region of D-loop in mtDNA of the breast cancer.Methods It analysed the HV2 region of D-loop in mtDNA in the 20 cases invasive ductual breast carcinoma and 20 cases paracarcinoma tissues by PCR and PCR-single stranded conformation polymorism.Results The 7 cases exceptional bands were found from 20 breast carcinoma in all of the samples by PCR-SSCP；and the sequencing results indicated that 31 new HV2 mutations were found in 7 sequencing specimens，the 3 of them were mitochondrial microsatellite instability（MSI）；the 7 of them were frameshift mutations；others were point mutation；and the 7 of them located in the region of mtDNA replication and transcription.Conclusion The mtDNA HV2 region is a highly polymorphic and mutatble region，that could be some relations in the breast carcinoma development.

Key words：Invasive ductual breast carcinoma；mtDNA；HV2；PCR-single stranded conformation polymorism

线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）存在于细胞质的线粒体中，是细胞内唯一的核外遗传物质，由16569bp组成的双链闭合环状分子，含有自我复制、转录和翻译的遗传体系。mtDNA含有37个编码基因，包括编码氧化磷酸化系统13个蛋白质的亚单位、2个rRNA及22个tRNA的结构基因。由于不受组蛋白保护，修复功能不完善，很容易成为致癌物质攻击的标靶。因此mtDNA的突变与细胞癌变之间的关系已经越来越受到重视，成为研究的热点。本文利用PCR-SSCP和基因测序法对mtDNA D-loop环HV2区的基因突变情况进行了研究，并探讨了突变在乳腺癌进程中的作用。

1 资料与方法

1.1一般资料 取自2004年5月～2005年7月延边大学附属医院肿瘤外科手术的患者，20例乳腺癌组织及相对应的癌旁正常组织，手术后切除部分组织立即投入液氮中，后放入-80℃冰箱中保存备用。20例乳腺癌患者年龄为36～73岁，平均（51.15±9.54）岁，所选标本均经病理确诊为浸润性导管癌。

1.2方法

1.2.1组织DNA提取 应用小量组织DNA提取纯化试剂盒进行组织DNA的提取，并用1%琼脂糖凝胶电泳和核酸蛋白定量分析仪进行DNA提取及纯度检测。选用GeneAmp 2400型PCR扩增仪进行PCR扩增。引物序列为HV2：5'-CTC ACG GGA GCT CTC CAT GC-3'（sense）；5'-GAC TGT TAA AAG TGC ATA CCG C-3'（antisense）；扩增产物大小为403bp，在94℃预变性5分，之后进入循环，94℃30s，退火60℃30s，72℃30s，共35个循环，后72℃延伸7分，4℃冷却。2%琼脂糖凝胶检验PCR扩增产物。

1.2.2 PCR-SSCP分析 取PCR产物10μl与等量的2×上样缓冲液，98℃变性5分，冰浴15 min。然后取该变性液5μl上样于8%聚丙烯酰氨凝胶，220伏电压电泳3 h后，进行银染观察分析条带：1%HNO3中氧化20分，蒸馏水中冲洗2次，20s/次；12mM硝酸银中染色30分，蒸馏水中冲洗2次，20s/次；0.28mM碳酸钠和0.04%甲醛混合液中显色至色带清晰；10%冰醋酸中终止染色固定5分。

1.2.3基因测序 PCR-SSCP分析出现异常条带者，用相应的DNA再次扩增，再经过PCR-SSCP分析，仍出现异常条带者，将PCR产物纯化后基因测序分析。

1.3统计学分析 用SPSS 11.5软件进行数据处理，各组实验结果用（x±s）表示，采用单样本t检验和单因素方差分析检验各组资料间的统计学差异，P<0.05为差异具有统计学意义，P<0.01为差异具有显著的统计学意义。

2 结果

2.1组织DNA提取、PCR扩增和PCR-SSCP结果 DNA样本经核酸蛋白分析仪检测，OD260/OD280均≥1.7；HV2基因PCR扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳检测均显示单一条带，与DNA Marker所提供的片段定位相符，说明所检测的片段上没有明显的插入和缺失。结果发现20例乳腺癌患者中有7例患者经过PCR-SSCP分析出现异常区带。

2.2测序结果 本研究在7例乳腺癌组织mtDNA在乳腺癌组织mtDNA D-loop环HV2区，有7处发生移码突变（单个核插入或缺失）其余均为点突变，转录因子X（TFX，nt 233-260）有2例3次突变、Y（TFY，nt 276-303）有1例次突变。共有23差异位点位于重链起始区（OH，nt 110-441）。

3 讨论

mtDNA与核基因组一样也存在不稳定，其形式以D-loop环区（CA）n和polyC长度不稳定多见[1-2]。Aral等[3-4]用限制性内切酶BsaXI找到了一个迅速检测D310多态性的一种方法。甲状腺癌[5]、乳腺癌、膀胱癌、及子宫内膜癌、宫颈癌中均存在D310区突变。本研究中11例标本均发生微卫星不稳定，且都位于D310区域，D310是位于D-环区303～315的polyC序列，是实体肿瘤突变的热点，其突变形式多为单碱基插入或缺失。线粒体基因组不稳定的原因可能是活性氧的破坏﹑滑链错配和不平衡交换。并且对甲状腺癌的研究发现D310区突变与肿瘤的组织类型和分化程度无关。负责mtDNA复制的DNA聚合酶γ在4个核苷酸以上的多聚核苷酸区复制的忠实性低可能是D310区具有高突变率的主要原因。D310的长度变化可能通过影响mtDNA复制或使肿瘤细胞获得选择性生长优势而促进肿瘤的发生。

本研究使用PCR-SSCP方法检测测了20例乳腺癌患者的癌组织和癌旁组织HV2区，共发现32个多态性变化。除了与基因库记载相重复的多态性变化外，又发现新的多态性位点10个，可见HV2区是一个具有高度多态性的区域，而这种多态性反映了线粒体DNA的核苷酸顺序是1981年Sanger等通过对西方人线粒体DNA测序得出的，因此在本研究中发现的新的多态性也可能是人种和地域差异的反映。

通过统计分析mtDNA基因突变浸润性导管癌与乳腺纤维腺瘤无显著性，但是乳腺纤维腺瘤的突变率要高于浸润性导管癌提示线粒体变异可能是妇科恶性肿瘤形成过程中的一个早期现象，并持续存在于癌症演变的全过程。但由于本研究所测例数较少，尚有待于进一步证实。因为检测肿瘤细胞中的mtDNA突变比检测核DNA（nDNA）突变要简单可靠，因此，检测组织细胞中mtDNA突变有可能成为一种肿瘤辅助诊断方法。

参考文献：

[1]Parrella P，Seripa D，Matera MG，et al.Mutations of the D310 mitochondrial mononucleotide repeat in primary tumors and cytological speciments[J].Cancer Lett，2003，190（1）：73-77.

[2]Wei L，Zhao Y，Guo TK，et al.Association of mtDNA D-loop polymorphisms with risk of gastric cancer in Chinese population.[J].Pathol Oncol Res，2011，17（3）：735-742.

[3]Aral C，Kaya H，Celikel CA，et al.A novel approach for rapid screening of mitochondrial D310 polymorphism[J].BMC Cancer，2006，6（1）：21-25.

[4]Yu M，Shi Y，Zhang F，et al.Sequence variations of mitochondrial DNA D-loop region are highly frequent events in familial breast cancer[J].J Biomed Sci，2008，15（4）：535-534.

[5]Ding Z，Ji J，Chen G，et al.Analysis of mitochondrial DNA mutations in D-loop region in thyroid lesions.[J].Biochim Biophys Acta，2010，1800（3）：271-274.

編辑/金昊天