高兵兵，吴月奎，马建华，易波，戴宜武

(安徽医科大学北京军区总医院，北京100700)

大麻二酚对急性脑出血小鼠的神经保护作用及其机制

高兵兵，吴月奎，马建华，易波，戴宜武

(安徽医科大学北京军区总医院，北京100700)

目的 探讨大麻二酚对急性脑出血小鼠的神经保护作用及其机制。方法 将72只C57BL/6小鼠随机分为假手术组、模型组和大麻二酚组，每组24只。模型组和大麻二酚组采用Ⅶ型胶原酶注入纹状体的方法制备急性脑出血模型，假手术组注入等量生理盐水。大麻二酚组术后2、12、24、48 h腹腔注射大麻二酚20 mg/kg。术后2、72 h采用神经行为学评分评价各组神经功能；术后72 h检测脑组织含水量，采用ELISA法检测脑组织IL-1β、IL-6表达，TUNEL染色后计数神经细胞凋亡数量。结果 模型组、大麻二酚组和假手术组术后2、72 h神经行为学评分均依次降低，两两比较P均<0.05。模型组、大麻二酚组和假手术组脑组织含水量、神经细胞凋亡数量和脑组织IL-1β、IL-6表达均依次降低，两两比较P均<0.05。结论 大麻二酚对急性脑出血小鼠具有神经保护作用；抑制IL-1β、IL-6表达可能为其作用机制。

急性脑出血；大麻二酚；脑水肿；炎症；神经细胞凋亡；小鼠

脑出血是一种急性脑卒中，患者多合并严重的神经损伤[1，2]。研究表明，继发性脑水肿、神经炎症反应和神经元凋亡均可造成脑出血患者的神经损伤[3，4]。大麻二酚提取于天然植物大麻，无精神效应，对焦虑、抑郁、惊厥和肿瘤等均具有治疗作用[5]。但目前关于大麻二酚对脑出血后神经损伤的治疗作用鲜见报道。2015年5～12月，我们观察了大麻二酚对急性脑出血小鼠的神经保护作用，现分析结果并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物：雄性C57BL/6小鼠72只，10周龄，体质量20～25 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。主要试剂及仪器：大麻二酚溶液购于上海源叶生物科技有限公司，Ⅶ型胶原酶购于美国Sigma公司，ELISA试剂盒购于美国Minneapolis公司，TUNEL试剂盒购于德国Roche公司；立体定向仪购于美国Stoelting公司。

1.2 急性脑出血模型制备 将72只小鼠随机分为大麻二酚组、模型组和假手术组各24只。大麻二酚组及模型组制备脑出血模型：3.6%水合氯醛(0.1 mL/10 g)腹腔注射麻醉，小鼠固定于立体定向仪。剪开头皮，充分暴露前囟，以前囟为原点定位钻孔(右1.8 mm、前0.8 mm、硬膜下3.0 mm)，将150 mL胶原酶生理盐水混合液(含0.05 U Ⅶ型胶原酶)注入纹状体，停针10 min后缓慢拔针，缝合头皮；假手术组注入150 mL生理盐水，其余处理同大麻二酚组、模型组。各组术后2 h通过Grid Test行神经行为学评分， 0分为运动功能正常；1分为提起尾部后小鼠双侧前肢和躯干屈曲；2分为小鼠向脑出血侧旋转，但休息时姿势正常；3分为小鼠向脑出血侧旋转，休息时向脑出血侧依靠；4分小鼠为向脑出血侧滚动；5分为小鼠休息时向脑出血侧依靠(无自主活动)。结果显示，大麻二酚组、模型组神经行为学评分均为(5.0±0.0)分，均明显高于假手术组0分(P均<0.05)；证实急性脑出血模型制备成功。

1.3 分组处理 三组分别于术后2、12、24、48 h腹腔注射0.5 mL/20 g混合液(2%吐温80+生理盐水)，大麻二酚组同时腹腔注射20 mg/kg大麻二酚(0.4 mg/0.5 mL)。

1.4 相关指标观察

1.4.1 神经行为学评分 各组术后72 h随机选取16只小鼠，参照1.2的方法行神经行为学评分，以评价神经功能。

1.4.2 脑组织含水量 各组术后72 h随机选择8只处死，迅速取出大脑，分离出血侧脑组织。称量大脑湿重，将其在100 ℃烘箱中持续烘干24 h，称量大脑干重。脑组织含水量=(大脑湿重-大脑干重)/大脑湿重×100%。

1.4.3 脑组织IL-1β、IL-6表达 采用ELISA法。各组术后72 h另取8只处死，迅速取出大脑，分离出血侧脑组织，-80 ℃冰箱保存。采用ELISA试剂盒检测脑组织IL-1β、IL-6表达，严格按照试剂盒说明书操作。

1.4.4 神经细胞凋亡情况 采用TUNEL染色。各组均于术后72 h取剩余8只小鼠固定好的脑组织，采用15%和30% PBS蔗糖溶液进行梯度脱水，15 μm厚度切片。4 ℃条件下，将脑组织切片在含0.1%Triton X-100、0.1%柠檬酸钠的PBS溶液中孵育2 min，PBS溶液冲洗3次，每次5 min；每个切片上加50 μL TUNEL反应混合液(TdT/荧光素标记的dUTP=1/9)，37 ℃条件下暗湿盒中反应1 h，PBS洗3次；加入50 μL converter-POD，37 ℃条件下暗湿盒中反应1 h，PBS洗3次。加入50 μL DAB底物，室温下反应10 min，PBS漂洗3次，最后进行苏木素染色。200倍光学显微镜下随机选取4个视野，计数凋亡细胞数量，取平均值。凋亡细胞核染色呈棕色，正常细胞核染色呈蓝色。

2 结果

2.1 各组神经行为学评分 模型组术后72 h神经行为学评分为(3.4±0.5)分，大麻二酚组为(1.9±0.6)分，假手术组为0分；三组神经行为学评分依次降低，两两比较P均<0.05。

2.2 各组脑组织含水量比较 模型组术后72 h脑组织含水量为81.65%±0.39%，大麻二酚组为79.50%±0.08%，假手术组为78.91%±0.12%；三组脑组织含水量依次降低，两两比较P均<0.05。

2.3 各组脑组织IL-1β、IL-6表达比较 模型组、大麻二酚组和假手术组脑组织IL-1β、IL-6表达均依次降低，两两比较P均<0.05。见表1。

表1 各组脑组织IL-1β、IL-6表达比较

注：与模型组比较，*P<0.05；与大麻二酚组比较，#P<0.05。

2.4 各组神经细胞凋亡数量比较 术后72 h模型组神经细胞凋亡数量为(119.4±8.2)个，大麻二酚组为(73.4±4.9)个，假手术组为(17.0±3.7)个；三组神经细胞凋亡数量依次降低，两两比较P均<0.05。

2.5 神经细胞凋亡数量与其他指标的关系 Spearman相关分析显示，小鼠神经细胞凋亡数量与神经行为学评分、脑组织含水量、脑组织IL-1β表达、脑组织IL-6表达均呈正相关(r分别为0.512、0.525、0.379、0.370，P均<0.05)。

3 讨论

脑水肿是脑出血后的继发性损伤之一，可导致颅内压增高、脑组织损伤、脑疝等，从而危及患者生命[3,6]。脑水肿经典的发生机制为血管源性水肿和细胞毒性水肿，脑出血后的一系列病理变化，包括静水压改变和血凝块回缩等导致血清蛋白渗入到周围组织中，激活凝血系统并产生凝血酶，促进炎症因子表达并破坏血脑屏障，进而导致血管源性水肿；随后红细胞裂解释放出血红蛋白，介导细胞毒性[2,6～8]。本研究结果显示，模型组、大麻二酚组和假手术组脑组织含水量依次降低，组间两两比较有统计学差异；说明大麻二酚能减轻急性脑出血小鼠的脑水肿，但是其具体机制尚不明确。

在急性脑出血过程中，小胶质细胞、星型胶质细胞、神经元和内膜细胞等均可分泌炎症介质，如IL-1、IL-6等，这些炎症介质刺激细胞黏附因子表达，从而促进白细胞黏附、迁移到脑实质中，参与脑损伤[9～12]。本研究结模型组、大麻二酚组和假手术组脑组织IL-1和IL-6表达依次降低，组间两两比较有统计学差异；说明大麻二酚能抑制炎症因子的表达，进而抑制炎症反应；其机制可能与大麻二酚抑制星型胶质细胞和小胶质细胞的激活和聚集，从而抑制炎症介质的释放有关[12，13]，仍需进一步研究。

研究证实，脑出血所导致的细胞凋亡主要存在于血肿周围，远离血肿区域并无明显的细胞凋亡[14]。炎症反应可导致神经细胞凋亡，包括神经元、星型胶质细胞和内膜细胞等，凋亡细胞可激活小胶质细胞和星型胶质细胞，并促进其聚集，释放炎症介质，加重炎症反应[14～16]。本研究模型组、大麻二酚组和假手术组神经行为学评分和神经细胞凋亡数量均依次降低，组间两两比较有统计学差异，且神经行为学评分和神经细胞凋亡数量呈正相关；说明大麻二酚具有抑制神经细胞凋亡，保护神经功能的作用。

综上所述，大麻二酚对急性脑出血小鼠具有神经保护作用；其机制可能与抑制IL-1、IL-6表达有关。

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国家自然科学基金资助项目(81271391)。

戴宜武(E-mail: daiyiwuu@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.04.010

R743.34

A

1002-266X(2017)04-0034-03

2016-01-14)