张璐++董文斌

摘要：目的 通过检测和观察母婴分离致大鼠海马区KLK8的分泌表达水平变化，探讨新生期母婴分离导致大鼠成年后行为异常的可能机制。方法 取新生Wistar大鼠24只，即刻分为对照组和分离组，12只为一组，其中将分离组的Wistar鼠在出生后的次日与母亲分离，对照组大鼠与母鼠同笼。出生6周后，处死Wistar大鼠，取海马组织，HE染色后切片，取出大鼠海马，检测其海马组织中klk8的水平。应用Image-Pro Plus （IPP） 6.0软件系统对免疫组化多个图像逐一做半定量分析。结果 ：经过母婴分离的Wistar大鼠，在其成年后，kLK8的表达与对照组相比明显降低 （P<0.01），提示这种差异有统计学意义。 结论 大鼠在新生期进行母婴分离，可致大鼠海马KLK8的表达出现下降，这对神经信号可产生影响，使其突触的可塑性出现变化，随后对行为产生影响。

关键词：母婴分离；海马；激肽释放酶8

Effects of Maternal and Neonatal Isolation on KLK8 of Hippocampus in Neonatal Rats

ZHANG Lu1，DONG Wen-bin2

（1.Neonatal Department，Maternal and Child Health Care Hospital of Luzhou，Luzhou 646000，Sichuan，China；2.Neonatal Department，The Affiliated Hospital of Southwest Medical University，Luzhou 646000，Sichuan，China）

Abstract：Objective To detect the expression level of KLK8 in rats' hippocampal tissue after maternal separation， and explore the potential mechanism of rats' abnormal behavior resulted from maternal separation in neonatal period. Methods 24 Wistar neonatal rats were divided into maternal separation group and control group. Nothing was done to the rats in the control group. After 6 weeks， rats were killed.After the hippocampus tissue were determined by use of HE staining ， The expression of KLK8 in rat's hippocampal tissue were detected by immunohistochemistry. Image-Pro Plus software which were used to semiquantitative assessment the immuneohistochemical images. Results Immunohistochemistry showed that KLK8 expression level in hippocampal tissue were significantly decreased in NMS group compared with the control group （P<0.01）. Conclusion The expression of KLK8 were decreased in hippocampatissue after maternal separation， may to a certain extent affected the neural signal transduction and synaptic plasticity，which are possibly related to the rats' abnormal behavior.

Key words：Maternal separation； Hippocampus； Tissue kallikrein 8； Abnormal behavior

研究證实，早期应激事件会导致成人后发生心理疾病，例如，在童年的家庭暴力，在成年后很容易出现心境障碍或创伤后应激障碍（post-traumatic disorder，PTSD）[1-3]。

当代研究表明，长时间的母婴分离（Neonate Mother Separation，NMS）可能造成成年后学习记忆力减退，认知障碍，还会引起焦虑样的行为等，过早的母婴分离会导致人体应激系统功能障碍和异常行为，这种负面影响在青少年时期甚至成年后依然存在[4]。由母婴分离的大鼠动物模型可知，如果在大鼠新生期给以母婴分离后，大鼠成年后自发活动减少，出现认知力差，精神焦虑抑郁，对内脏疼痛更加敏感，神经元重塑也会受损害[5-6]。

组织激肽释放酶（tissue kallikrein，KLK）是一种分泌型丝氨酸蛋白酶，参与学习和记忆的过程。人类的KLK8分布在许多正常组织，包括皮肤，食道，睾丸，扁桃体，肾，乳腺表达，和唾液腺[7]，越来越多的证据表明在发展神经蛋白酶，成熟，老化和认知功能的方面。

研究表明，就发育水平而言，出生后2周岁儿童的发育水平与28 d的大鼠发育程度相当[8]，本研究在前期建立大鼠母婴分离模型基础上，以KLK8为出发点，探讨母婴分离的大鼠海马KLK8诱导表达水平的变化，以研究新生期母婴分离可能会导致大鼠成年后异常行为的机制。

1 资料与方法

1.1一般资料 我们采用3月健康Wistar大鼠（由西南医科大学实验动物中心提供），其中雄性5只，雌性10只，均未进行交配，在西南医科大学实验室动物房饲养，大鼠可以自由饮水和进食。体重为190～300 g，按雌雄2∶1合笼成功交配后，取出孕鼠，单独喂养。孕鼠生产后，将一只哺乳期大鼠和12只新生鼠同笼喂养。

1.2 主要实验试剂 激肽释放酶-8抗体 bs-5871R Rb a KlK8：北京博奥森生物技术有限公司，中国；SP免疫组化试剂盒： 北京博奥森生物技术有限公司，中国。

1.3方法

1.3.1模型建立及实验分组[9] 取新生Wistar大鼠24只，分组为对照组，分离组两组，12只为一组，其中将分离组的大鼠在出生后的第2 d与哺乳母鼠分离，3 h/d，3 h后将新生的Wistar大鼠送回笼中与哺乳母鼠相聚，总共21 d，对照组大鼠与母鼠同笼。正常喂养。

2.2灌注固定和取材 大鼠出生8 w后取材，麻醉后断头处死，手术取出脑组织，经过固定，脱水，浸透，包埋，取冠状位海马切片，HE染色，

2.4结果分析 切片中包浆中以出现棕黄色颗粒可视为阳性，在Olympus光镜下（10×40），用图文拍照软件将每张切片取5个不同视野拍照。采用Image-Pro Plus（IPP）6.0图象分析体系对所拍摄的图象做半定量分析，测定免疫反应产物KLK8的平均吸光度值（average optical density.AOD），取平均值，作为此片的光密度值，进行统计分析。

2.5统计学分析处理 采用SPSS 16.0 软件对数据进行分析，将所有计量资料表示采用均数±标准差（x±s），用单因素方差比较分析，t检验进行组间比较，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

检测出经过新生期母婴分离后的大鼠海马组织KLK8的表达水平 阳性标准为：棕黄色产物，呈颗粒状，KLK8主要在海马神经元细胞内进行表达。经过NMS的Wistar大鼠在成年以后，KLK8表达水平与对照组相比明显降低（P<0.01），差异具有统计学意义，见表1，图1。

3 讨论

有报道称电生理和行为研究中发现组织KLK8影响海马的重塑[10]，KLK8是激肽释放酶家族的重要成员，属于丝氨酸蛋白酶，KLK8广泛存在于组织和体液中，在脑和皮肤、乳腺、卵巢等中都检测出了它的分泌水平，特别是，在脑海马中高表达，和学习记忆，神经发育相关。它可以通过参与E-LTP，参与降解L1和影响胞外蛋白酶来参与海马突触重塑。

本试验中证明新生期母婴分离会使大鼠海马中KLK8分泌水平下降，该变化会影响海马突触的重塑，并影响神经元的功能，从而影响大鼠的记忆和认知功能。

结论母婴分离后的Wistar大鼠，KLK8在海马中的表达量一直低于未进行母婴分离的对照组，KLK8表达的下降可能导致大鼠记忆和认知障碍。

参考文献：

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[5]孫鸿燕，朱小霞，等.新生期母婴分离对大鼠成年后行为的影响及机制[J].中国妇幼健康研究，2011，26（19）：2984-2986.

[6]杨燕珍，吴斌.新生鼠母婴分离对心理行为的影响及相关机制[J].中国妇幼健康研究，2008，（19）：479-481.

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[10]Diamandis EP，Yousef GM.Human tissue kallikreins a family of new cancerbiomarkers[J].Clin Chem，2002，48（8）：1198-1205.

编辑/张燕