刘 衡，姜 莉，许晓勇，夏 俊，宋育林

(1安徽医科大学第一附属医院 a.消化内科； b.肝胆外科，合肥 230022；2 合肥市第三人民医院 检验科，合肥 230022)

Y-box结合蛋白1过表达对肝内胆管癌患者术后辅助化疗预后的影响

刘 衡1a，姜 莉2，许晓勇1a，夏 俊1b，宋育林1a

(1安徽医科大学第一附属医院 a.消化内科； b.肝胆外科，合肥 230022；2 合肥市第三人民医院 检验科，合肥 230022)

目的 探讨Y-box结合蛋白(YB)1过表达与肝内胆管癌患者术后辅助化疗预后的关系。方法 收集2010年1月-2015年1月于安徽医科大学第一附属医院行手术治疗并辅助术后化疗的58例肝内胆管癌患者的石蜡标本。使用免疫组化方法检测肝内胆管癌组织中YB-1表达情况，使用噻唑蓝方法检测YB-1质粒转染肝内胆管癌细胞对吉西他滨药物敏感性的改变。qPCR检测YB-1质粒转染肝内胆管癌细胞后多药耐受基因表达改变情况。计量资料2组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析；计数资料组间比较采用χ2检验；Kaplan-Meier方法计算生存曲线，生存分析采用log-rank检验。结果 58例患者中44例(75.9%)患者YB-1在肝内胆管癌组织细胞胞浆中呈高表达(YB-1胞浆阳性组)，14例(24.1%)YB-1胞浆阴性(YB-1胞浆阴性组)；44例YB-1胞浆阳性患者中有18例(40.9%)癌组织的细胞中出现YB-1核染色阳性(YB-1胞核阳性组)，其余40例为YB-1胞核阴性组。YB-1胞核阴性组患者术后辅助化疗生存时间显著长于YB-1胞核阳性组患者(63 个月 vs 28 个月，χ2=17.99，P<0.05)。对照质粒组HCCC-9810对吉西他滨的半数抑制量(IC50)为0.054 μmol,YB-1过表达后pSG5-YB-1质粒转染组IC50增加至0.460 μmol,较前者升高近10倍，差异有统计学意义(P<0.05)。pSG5-YB-1质粒转染HCCC-9810细胞后，YB-1转录水平明显升高(t=19.02，P<0.05)。HCCC-9810细胞在过表达YB-1之后多药耐受蛋白(MDR)1、多药耐受相关蛋白(MRP)1转录水均明显升高，差异均有统计学意义(t值分别为13.34、11.35，P值均<0.05)。结论 YB-1在大多数肝内胆管癌组织中呈过表达，其中YB-1胞核阳性表达可能预示术后辅助化疗效果不佳，与MDR1、MRP1多药耐受基因表达后多药耐受性的增加有关。

胆道肿瘤； Y盒结合蛋白质1； 药物耐受性； 预后

Y-box结合蛋白(Y-box binding protein，YB)1作为一种与目的基因启动子、增强子内部Y-box序列(5’-CTGATTGGCCAA-3’)特异性结合的转录因子，可发挥调节细胞增殖、分化、迁移等多种重要的生物学功能[1]。YB-1作为一种可分泌的多功能蛋白，其生物学功能不仅与其自身结构域有关，亚细胞定位也是重要的决定因素[2]。生理情况下YB-1大多定位于细胞浆中，作为包装信使核糖核蛋白体的功能蛋白，起到调节mRNA翻译、稳定性以及定位的作用[2]。当细胞受到各种应激因素刺激(如紫外线、加热、抗肿瘤药物、感染等)时，YB-1可由胞浆转移至胞核内，作为转录因子调节多种基因表达，同时还涉及DNA修复、复制以及前mRNA拼接[1-2]。目前关于YB-1在肝内胆管癌中表达的研究尚少，本研究通过免疫组化检测YB-1在肝内胆管癌组织中的表达情况，并观察YB-1过表达对肝内胆管细胞癌多药耐受性的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2010年1月-2015年1月于安徽医科大学第一附属医院行手术治疗并辅助术后化疗的58例肝内胆管癌患者的石蜡标本，其中男32例，女26例，年龄41～77岁，中位发病年龄63岁。按照《2014 年美国肝胆胰学会共识声明:肝内胆管癌管理》[3]临床分期标准分为：Ⅲ期37例，Ⅳ期21例。术后给予吉西他滨联合顺铂治疗27例，吉西他滨联合环磷酰胺15例，单用环磷酰胺10例，使用其他化疗药物6例。随访截止日期为2015年12月30日，中位随访26个月，2例失访(失访率3.4%)。

1.2 材料与试剂 人肝内胆管癌细胞株HCCC-9810购自中国科学院细胞库，培养于含10% FBS的RPMI1640培养基(购自Gibco公司)中，置于37 ℃，5% CO2培养箱中培养。Lipofectamine2000转染试剂购自Invitrogen公司，pSG5-YB-1质粒由德国奥托·冯·居里克大学Peter R Mertens教授惠赠，pSG5-Vector购自Agilent公司，噻唑蓝购自碧云天生物科技研究所，高纯度RNA提取试剂盒购自Roche公司，第一链cDNA反转录试剂盒和SYBR Green PCR荧光定量PCR试剂盒购自TaKaRa公司，兔抗人YB-1单克隆抗体购自Abcam公司，即用型兔超敏二步法免疫组织化学检测试剂、二氨基联苯胺显色试剂盒购于北京中杉金桥生物科技有限公司。

1.3 免疫组化方法 将石蜡标本依次脱蜡、梯度水化、采用微波法进行抗原修复，1 mmol EDTA(pH 8.4)缓冲溶液微波抗原热修复10 min，3%过氧化氢溶液冲洗，PBS清洗3次，山羊血清室温封闭30 min，加入兔抗人YB-1单克隆抗体(1∶100)，4 ℃湿盒过夜，PBS清洗3次，顺序滴加兔超敏免疫组化试剂1、2并清洗，二氨基联苯胺显色，苏木素复染，盐酸酒精分化，中性树胶封片。以PBS代替一抗作为阴性对照组，以已知的表达阳性的组织切片作为阳性对照组。由2位高资历的病理医师进行双盲式阅片。在显微镜100倍视野下，每张切片随机选择5个区域，YB-1主要定位于细胞质，呈黄色颗粒样，其中部分病例还出现胞核染色阳性。根据阳性细胞的比例和染色强度进行半定量积分：阳性细胞所占比例为0、1%～10%、11%～30%、31%～50%、51%～80%、81%～100%，依次计为0、1、2、3、4、5分；染色强度为：阴性、弱阳性(淡黄色)、中等阳性(棕黄色)和强阳性(棕褐色)，依次计为0、1、2、3分。免疫组化积分=阳性细胞占比分数×染色强度分数，理论分值为0～15分，其中≥3分判定为阳性表达，0～2分判定为无阳性表达。

1.4 质粒转染 取对数生长期HCCC-9810细胞，采用Lipofectamine2000转染法进行YB-1过表达治疗转染，操作流程按照说明书进行。48 h后取细胞用于后续实验。

1.5 肝内胆管癌细胞对吉西他滨敏感性测定 分别取对照质粒组及pSG5-YB-1质粒转染组的HCCC-9810细胞配制成1×105/ml的细胞悬液，以200 μl/孔接种于96孔，37 ℃孵育箱中培养6 h，使细胞贴壁。更换培养基后，按终浓度0.01、0.1、1、10、100 μmol分别向每组中加入吉西他滨，其中0 μmol组加入等体积PBS设为对照组。继续培养48 h。采用噻唑蓝方法检测细胞增殖能力，每组设6个复孔。采用GraphPad Prim 6软件分别计算对照质粒组、pSG5-YB-1质粒转染组HCCC-9810对吉西他滨的半数抑制量(IC50)。

1.6 qPCR检测 分别提取对照质粒组、pSG5-YB-1组HCCC-9810细胞RNA，转录合成cDNA，-20 ℃保存。多药耐受蛋白(multi-drug resistance，MDR)1、多药耐受相关蛋白(multi-drug resistant associate protein，MRP)1和乳腺癌耐药相关蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP)引物由上海生工生物技术工程服务有限公司合成，引物序列见表1。按照SYBR Green PCR荧光定量PCR试剂盒操作流程进行操作。

2 结果

2.1 免疫组化结果

2.1.1 YB-1蛋白在肝内胆管癌组织中的表达 58例患者中44例(75.9%)患者YB-1在肝内胆管癌组织细胞胞浆中呈高表达(YB-1胞浆阳性组)，14例(24.1%)YB-1胞浆阴性(YB-1胞浆阴性组)；58例患者中18例(40.9%)癌组织的细胞中出现YB-1核染色阳性(YB-1胞核阳性组,均为胞浆阳性)，其余40例为YB-1胞核阴性组。因此，YB-1在本研究的肝内胆管癌样本中主要存在3种表达模式：YB-1胞浆阴性/胞核阴性(图1a，b)、YB-1胞浆阳性/胞核阴性(图1c，d)和YB-1胞浆阳性/胞核阳性(图1e，f)。结合临床资料分析发现，Ⅳ期(21例)肝内胆管癌组织中YB-1胞浆阳性表达率(18/21，85.7%)高于Ⅲ期患者(26/37，70.3%)，但2者间差异无统计学意义(P>0.05)。YB-1胞浆、胞核阳性表达率在不同性别、年龄、临床分期组间比较差异亦无统计学意义(P值均>0.05)(表2)。

2.1.2 YB-1不同表达模式与术后辅助化疗患者预后的关系 生存分析显示，YB-1胞浆阳性组患者中位生存期为46个月，YB-1胞浆阴性组患者中位生存期为55个月，2组间比较差异无统计学意义(P>0.05)(图2)；YB-1胞核阳性组患者中位生存期仅28个月，但YB-1胞核阴性组中位生存期为63个月，2组间比较差异有统计学意义(χ2=17.99，P<0.05)(图3)。

表1 引物序列

表2 YB-1表达与肝内胆管癌临床参数的关系

图1 YB-1在肝内胆管癌组织中的表达 a,b:YB-1胞浆阴性/胞核阴性; c,d:YB-1胞浆阳性/胞核阴性; e,f:YB-1胞浆阳性/胞核阳性

图2 YB-1胞浆阳性组与阴性组患者术后辅助化疗预后分析

图3 YB-1胞核阳性组与阴性组患者术后辅助化疗预后分析

2.2 YB-1过表达对肝内胆管癌细胞吉西他滨药物敏感性的影响 对照质粒组HCCC-9810对吉西他滨的IC50为0.054 μmol，YB-1过表达后pSG5-YB-1质粒转染组IC50增加至0.460 μmol，较前者升高近10倍，差异有统计学意义(P<0.05)(图4)。

2.3 PCR结果 pSG5-YB-1质粒转染HCCC-9810细胞后，YB-1转录水平明显升高(t=19.02，P<0.05)，提示YB-1过表达实验成功。HCCC-9810细胞在过表达YB-1之后MDR1、MRP1转录水均明显升高，差异有统计学意义(t值分别为13.34、11.35，P值均<0.05)，BCRP转录水平虽有升高趋势，但与YB-1过表达前比较差异无统计学意义(P>0.05)(图5)。

图4 YB-1过表达对肝内胆管癌细胞吉西他滨药物敏感性的影响 *P<0.05

图5 YB-1过表达对肝内胆管癌细胞MDR1、MRP1和BCRPmRNA表达的影响 *P<0.05

3 讨论

肝内胆管癌是一种恶性度极高的原发肝脏肿瘤，手术是目前唯一可能治愈的手段[4]。然而由于本病早期症状不典型，大多数患者确诊时已失去手术机会。因此，对于大部分无法手术的进展期患者来说，化疗成为唯一可能改善患者预后的治疗手段，但疗效却不容乐观[4-5]。肿瘤细胞常出现多药耐受性表型，是化疗失败的主要原因[6]。其中肿瘤细胞高表达药物外排泵蛋白将细胞内抗肿瘤药物排至细胞外是其形成多药耐受性表型的重要机制之一[7]。

本研究结果显示，YB-1在75.9%肝内胆管癌组织中高表达，主要表达于癌细胞胞浆，其中有40.9%合并胞核阳性表达。Yasen等[8]在肝细胞癌组织中发现，YB-1染色阳性率为89%(73/83)，其中11.0%(8/73)还同时存在YB-1胞核染色阳性。肝癌中YB-1胞浆高表达与肿瘤门静脉侵犯和更晚的临床分期有关。但在本研究中，肝内胆管癌细胞YB-1阳性表达与患者年龄、性别和临床分期无显著相关性。这可能与本研究的纳入对象以中晚期患者为主有关。进一步生存分析显示，YB-1胞核表达与肝内胆管癌术后辅助化疗预后不佳明显相关，而单纯YB-1胞浆表达与患者预后无明显相关性。因此，肝内胆管癌组织中出现YB-1胞核阳性表达提示患者术后辅助化疗预后不佳，与Yasen等[8]获得的结果相似。

既往研究[2]显示，YB-1蛋白过表达能够增加肿瘤多药耐受性。本研究YB-1过表达后HCCC-9810细胞对吉西他滨的IC50升高约10倍，提示过表达YB-1蛋白后肝内胆管癌细胞对吉西他滨的药物耐受性明显增加。同时，HCCC0-9810过表达YB-1后MDR1和MRP1 mRNA水平均明显升高。Shen等[9]在构建的5-氟尿嘧啶耐药肝内胆管癌细胞株中也发现，MDR1和MRP1 mRNA表达水平明显升高，而使用小干扰RNA抑制Wnt/β-catenin信号通路后，MDR1 mRNA表达水平随之降低，细胞株的耐药性也得到逆转。在乳腺癌、卵巢癌、弥漫大B细胞淋巴瘤等相关研究[10-13]中，YB-1过表达或核转移与MDR1表达水平增加明显相关。因此，本研究结果表明YB-1蛋白过表达后可能诱导MDR1、MRP1基因表达，增加肝内胆管癌细胞多药耐受性，从而导致术后辅助化疗效果不佳。然而在一项结肠癌细胞的研究[14]中却发现，过高热诱导YB-1核转移虽然能够上调MDR1 mRNA水平，但对细胞耐药性似乎并无明显影响，这提示除YB-1途径外，其他机制可能也参与了细胞多药耐药性的产生。

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引证本文：LIU H,JIANG L,XU XY,et al.Effect of Y-box binding protein 1 overexpression on the prognosis of patients with intrahepatic cholangiocarcinoma undergoing postoperative adjuvant chemotherapy[J].J Clin Hepatol,2017,33(2):324-328.(in Chinese)

刘衡，姜莉，许晓勇，等.Y-box结合蛋白1过表达对肝内胆管癌患者术后辅助化疗预后的影响[J].临床肝胆病杂志,2017,33(2):324-328.

(本文编辑：林 姣)

Effect of Y-box binding protein 1 overexpression on the prognosis of patients with intrahepatic cholangiocarcinoma undergoing postoperative adjuvant chemotherapy

LIUHeng,JIANGLi,XUXiaoyong,etal.

(DepartmentofGastroenterology,TheFirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230022,China)

Objective To investigate the association between Y-box binding protein 1 (YB-1) overexpression and the prognosis of patients with intrahepatic cholangiocarcinoma (ICC) undergoing postoperative adjuvant chemotherapy.Methods The paraffin-embedded specimens were collected from 58 patients with ICC who underwent surgical treatment and postoperative adjuvant chemotherapy in The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University from January 2010 to January 2015.Immunohistochemistry was used to measure the expression of YB-1 in ICC tissue; after ICC cells were transfected with YB-1 plasmid,the thiazolyl blue method was used to observe the change in gemcitabine sensitivity,and qPCR was used to observe the changes in the expression of multidrug resistance genes.The independent samplest-test was used for comparison of continuous data between two groups and a one-way analysis of variance was used for comparison of continuous data between multiple groups; the chi-square test was used for comparison of categorical data between groups.The Kaplan-Meier method was used to calculate survival rates and the log-rank test was used for survival difference analysis.Results Among the 58 patients,44 (75.9%) had high expression of YB-1 in the cytoplasm of ICC cells (cytoplasm YB-1 positive group) and 14 (24.1%) had no expression of YB-1 in the cytoplasm of ICC cells (cytoplasm YB-1 negative group).Of all patients in the cytoplasm YB-1 positive group,18 (40.9%) also had positive nuclear expression of YB-1 (nuclear YB-1 positive group); the other 40 patients had no nuclear expression of YB-1 (nuclear YB-1 negative group).The nuclear YB-1 negative group had a significantly longer survival time than the nuclear YB-1 positive group (63 months vs 28 months,χ2=17.99,P<0.05).In the control plasmid group,the half-maximal inhibitory concentration (IC50) of gemcitabine in HCCC-9810 cells was 0.054 μmol,and in the pSG5-YB-1 plasma transfection group,IC50increased to 0.460 μmol after YB-1 overexpression,which was 10 times higher than that in control plasmid group (P<0.05).There was a significant increase in the YB-1 transcriptional level after HCCC-9810 cells were transfected with pSG5-YB-1 plasmids (t=19.02,P<0.05).After YB-1 overexpression,HCCC-9810 cells had significant increases in the transcriptional levels of multidrug resistance protein 1 (MDR1) and multidrug resistance-associated protein 1 (MRP1) (t=13.34 and 11.35,bothP<0.05).Conclusion YB-1 overexpression can be found in most ICC tissues,and nuclear positive expression of YB-1 may indicate the poor effect of postoperative adjuvant chemotherapy,which may be associated with the increase in multidrug resistance after the expression of MDR1 and MRP1.

biliary tract neoplasms； Y-box-binding protein 1； drug tolerance； prognosis

10.3969/j.issn.1001-5256.2017.02.026

2016-09-26；

2016-10-12。

2016年度安徽省高校省级科学研究项目(KJ2016A337)

刘衡(1982-)，男，主治医师，博士，主要从事慢性肝病临床和基础研究。

宋育林，电子信箱：ylsongcn@163.com。

R735.8; Q513

A

1001-5256(2017)02-0324-05