武 静，王 慧，史 琴，藏印竹

(贵阳中医学院：1.解剖教研室；2.功能实验室；3.生理教研室；4.研究生学院 550002)

论著·基础研究 doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2017.04.003

PCPA失眠大鼠不同时间皮质前额叶ATP水平变化及酸枣仁汤的干预作用*

武 静1，王 慧2△，史 琴3，藏印竹4

(贵阳中医学院：1.解剖教研室；2.功能实验室；3.生理教研室；4.研究生学院 550002)

[摘要] 目的 研究氯苯丙氨酸(PCPA)诱导的失眠大鼠前额皮质三磷酸腺苷(ATP) 不同时间水平变化情况，探讨酸枣仁汤(SZRD)的干预机制。方法 大鼠分为正常对照组(不做任何操作)，SZRD对照组(第1、2、3天腹腔注射蒸馏水，第4～10天蒸馏水灌胃)，空白对照组，模型组，SZRD治疗组，五羟色氨酸(5-HTP)组，5-HTP+SZRD组。采用连续3 d腹腔注射PCPA的方法建立大鼠失眠模型，各组在实验的第4、5、6、8、10天分别取大鼠前额叶皮质，采用高效液相色谱法(HPLC)检测各组大鼠不同时间前额皮质ATP水平。结果 模型组大鼠实验第4、5、6、8、10天ATP水平显著下降，与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)；SZRD治疗组第4、5、6、8、10天ATP水平较模型组逐渐升高，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)；SZRD对照组前额叶皮质ATP水平与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)；空白对照组和正常对照组比较，前额皮质ATP水平差异无统计学意义(P>0.05)；5-HTP组与SZRD对照组、5-HTP+SZRD组之间比较差异也无统计学意义(P>0.05)。结论 SZRD与5-HTP本身对正常大鼠前额皮质ATP水平变化无显著影响，SZRD对前额皮质ATP的作用出现在PCPA所致失眠后。

腺苷三磷酸；芬克洛宁；入睡和睡眠障碍；酸枣仁汤；前额叶皮质

[Abstract] Objective The study is intended to examine changes in prefrontal cortex ATP concentrations over time in PCPA induced insomnia rats,and to examine the intervention effects of Suanzaoren decoction.Methods SD rats randomly assigned to normal control,control,model,SZRD control,SZRD treatment,5-HTP,and 5-HTP + SZRD groups.PCPA was injected intraperitoneally over three days to induce the insomnia model.One day after induction,at the fourth,fifth,sixth,eighth,and tenth days after experiment,subjects from each group were examined for prefrontal cortex ATP concentration using the HPLC method.Results Prefrontal cortex ATP concentrations in the PCPA Model group at the fourth,fifth,sixth,eighth,and tenth days were declined significantly compared with the Control group (P<0.01).Compared with the PCPA Model group,the SZRD treatment group showed significant (P<0.05) increase at the fourth,fifth,sixth,and eighth days after assay,and a significant increase (P<0.01) on the tenth day.A comparison of the Control group with the Normal control group,and a comparison among the SZRD control group,the 5-HTP,and 5-HTP+SZRD groups showed no significant differences in prefrontal cortex ATP concentrations.Conclusion SZRD with 5-HTP itself has no significant effect on normal rats prefrontal cortex ATP levels,SZRD role of the prefrontal cortex appear to the ATP after PCPA caused insomnia.

酸枣仁汤(cuanzaoren decoction,SZRD)作为治疗失眠症的经典方剂疗效确切，被历代医家推崇。笔者前期的研究表明，PCPA所致失眠大鼠脑内的神经胶质细胞被激活，SZRD对激活的神经胶质细胞具有一定的调节作用[1]。研究表明，神经胶质细胞能分泌ATP等物质调节多种神经功能活动[2]，有研究发现睡眠活动与脑内ATP的水平有密切关系[3]，脑内ATP在氯苯丙氨酸(PCPA)失眠大鼠发展过程中是如何变化的，其在失眠的不同时间段表现又如何？是值得研究的问题。本研究以PCPA失眠模型大鼠为对象，利用高效液相色谱(HPLC)法连续检测PCPA失眠后第4、5、6、8和第10天大脑皮质ATP动态变化过程，探讨皮质ATP在PCPA失眠过程中的作用及其变化规律，同时观察SZRD的干预作用，以期进一步探讨SZRD治疗失眠的作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 健康成年清洁级SD雄性大鼠245只，体质量200～220 g，由重庆腾鑫生物技术有限公司提供，许可证号：[SCXK(渝)2012-000J]。置于安静、温度保持恒定(22±2)℃、避免强光的环境中饲养7 d。

1.1.2 仪器 LC-10AT高效液相色谱仪、SPD-10A紫外检测器(日本岛津公司)；Milli-pore 0.22 μm滤膜和过滤器(美国Milli-pore公司)；AUM220D电子分析天平(日本Shimadzu公司)；低温离心机(北京时代北利离心机有限公司)。

1.1.3 试剂和药物 磷酸二氢钾、氢氧化钠、高氯酸、丙二醇均为市售分析纯，购自武汉华创化工有限公司；PCPA(批号1001685258)、5-羟色氨酸(5-HTP，批号101399644)购自Sigma公司。酸枣仁、川芎、知母、茯苓、甘草均购自贵阳中医学院第一附属医院中药房。

1.2 方法

1.2.1 药物制备 SZRD:由酸枣仁18 g，知母10 g，茯苓10 g，川芎5 g，甘草3 g组成，称取以上5味药材10付，共计460 g，加10倍量水，浸泡1 h后煎煮，煮沸后30 min滤过，药渣加5倍量水煎煮，煮沸后20 min滤过，合并滤液，浓缩成150%的水提物，分装灭菌，4 ℃冰箱储存备用。

1.2.2 动物分组与模型制备 SD成年大鼠245只，分为以下7个大组(每个大组35只大鼠，每个大组又在实验的第4、5、6、8、10天各分为一个亚组，共5个亚组，每个亚组7只大鼠):空白对照组、模型组、SZRD治疗组、5-HTP组、5-HTP+SZRD组、SZRD对照组、正常对照组。根据以往的实验方法并结合预实验结果，制作PCPA失眠模型大鼠，具体方法为：按350 mg/kg以10 mL/kg体积腹腔注射PCPA，于每天上午8:00～9:00进行，每天1次，持续3 d。

1.2.3 给药方法 空白对照组第1、2、3天腹腔注射蒸馏水，第4～10天蒸馏水灌胃；模型组组第1、2、3天腹腔注射PCPA(350 mg/kg)，第4～10天蒸馏水灌胃；5-HTP组第1、2、3天腹腔注射5-HTP(25 g/kg)，第4～10天蒸馏水灌胃；SZRD治疗组第1、2、3天腹腔注射PCPA，第4～10天SZRD(浓度为15 g/kg，即含生药1.5 g/mL)灌胃；5-HTP+SZRD组第1、2、3天腹腔注5-HTP(25 g/kg)，第4～10天SZRD(10 mL/kg)灌胃；SZRD对照组第1、2、3天腹腔注射蒸馏水，第4～10天SZRD灌胃；正常对照组不进行任何操作。

1.2.4 取材 各组在进行实验的第4、5、6、8、10天分别取材，取材方法如下：末次给药后2 h，40 mg/kg戊巴比妥钠麻醉后处死大鼠，冰上快速取出大鼠脑组织，去掉嗅球、小脑及低位脑干，取大脑皮质放入液氮，移至-80 ℃保存备用。

1.3 PCPA失眠后不同时间前额叶皮质 ATP水平检测方法

1.3.1 ATP标准储备液的配制 精密称取ATP标准对照品10.00 mg，置于10 mL棕色容量瓶中，加超纯水至刻度，摇匀，即得1.00 mg/mL的ATP标准液，置于4 ℃冰箱避光保存。

1.3.2 HPLC法检测PCPA给药后不同时间前额叶皮质ATP水平 (1)色谱条件∶色谱柱，Phenomemex C18(4.6×150 mm,5 μm);流动相比例号甲醇-磷酸盐缓冲液=2∶98(V/V)；流速0.8 mL/min；柱温25 ℃；检测波长254 nm。(2)样品前处理:精密称取大脑前额叶皮质组织0.1 g加入0.4 mol/L高氯酸 1.0 mL，冰上研磨1 min，低温高速离心10 min(4 ℃，11 200 r/min)，取上清液过0.22 μm 滤膜即成测定样品。(3)定性分析:将ATP标准液在色谱仪上以20 μL进样作色谱分析。在标准液的定性分析中，根据保留时间及紫外谱图判定该物质。ATP标准品的保留时间是4.598 min。(4)标准曲线的制备:在选定的色谱条件下，按外标定量法，配制ATP质量浓度分别为：0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL，取20 μL，依次进样，以ATP的峰面积为纵坐标，质量浓度(C，μg/mL) 为横坐标进行线性回归，得标准曲线方程为Y=1E+06X+98548(R2=0.998 7)。(5)样品水平测定:依前法检测各组标本。

2 结 果

2.1 模型制备结果 模型组大鼠腹腔注射PCPA 3 d造成失眠后，第4天ATP水平下降，在PCPA失眠第5、6、8、10天ATP水平均处于较低水平，与空白对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)，见表1。

2.2 SZRD对失眠眼大鼠前额叶皮质ATP水平的影响。

2.2.1 SZRD治疗组与模型组比较 SZRD治疗组PCPA失眠第4天ATP水平较低，但在PCPA失眠第5、6、8、10天ATP水平逐渐上升，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，见表1。

2.2.2 SZRD对照组与空白对照组比较 从实验第4～10天前额叶皮质ATP水平变化差异无统计学意义(P>0.05)，提示SZRD本身不能引起大脑皮质ATP水平变化。

2.2.3 正常对照组与空白对照组比较 从实验第4～10天前额叶皮质ATP水平变化差异无统计学意义(P>0.05)，表明腹腔注射与灌胃等手术操作对大脑皮质前额皮质ATP水平变化无明显影响。

表1 各组大鼠不同时间前额皮质ATP水平

a:P<0.01，与空白对照组比较；b:P<0.05，c:P<0.01，与模型组比较。

3 讨 论

ATP是体内的能量货币单位，能够维持脑细胞正常的生理功能[4]。近年来，ATP被认为是一种神经递质[5]，能调节兴奋性和抑制性的神经信息传递，它可作为神经递质调节神经元之间和神经元-神经胶质细胞之间信号传递[6]。研究发现，大鼠ATP含量在基底前脑、皮质扣带回及额叶觉醒时保持相对稳定，但在睡眠开始的几个小时内ATP的量大量上升，与心电图(EEG)的慢波形成对应关系，表明睡眠活动与脑内ATP水平有密切关系[7]。

PCPA失眠模型是通过PCPA阻断脑内5-HT的合成，造成动物失眠，是目前国内外较为公认的失眠模型[8-9]。PCPA(350 mg/kg)连续3 d对大鼠进行腹腔注射，大鼠逐渐饮水增多、饮食增加、明显活跃，对外界刺激较敏感，睡眠昼夜节律消失，提示复制失眠大鼠成功。

本研究结果表明，PCPA能导致大鼠前额皮质ATP水平下降，从失眠第4天至第10天ATP水平仍处于低水平。SZRD治疗组前额皮质ATP从失眠第5天开始至第10天水平增加，表明SZRD能增加PCPA失眠大鼠前额皮质的ATP水平。

有研究表明PCPA能够影响脑内前额皮质神经元功能，PCPA失眠3 d后线粒体开始肿胀，逐渐空泡化[10]。本课题组前期研究结果表明PCPA失眠大鼠大脑皮质中ATP酶活性发生变化[11]，导致细胞内、外离子分布失衡，进而影响神经细胞兴奋性变化。胡晓辉等[12]也证实PCPA失眠大鼠中缝背核galanin神经元发生变化，影响脑内的能量代谢过程。

本研究前期的实验发现SZRD可作用于PCPA失眠大鼠脑内的星形胶质细胞和小胶质细胞[1]，目前已知脑内的星形胶质细胞能释放ATP作为胶质递质,星形胶质细胞通过胞内钙离子依赖释放ATP[13]，影响神经元的生物学活动[14]。结合前期实验结果，本研究推测SZRD可能作用于神经胶质细胞，通过影响神经胶质细胞的功能而改变脑内ATP的水平。本研究还发现，SZRD不改变正常大鼠前额皮质的ATP水平，在未失眠大鼠，SZRD与5-HTP也无协同作用，灌胃与腹腔注射及手术操作也未显著影响前额皮质ATP水平，5-HTP组、5-HTP+SZRD组及SZRD对照组从实验第4～10天，前额叶皮质ATP水平与模型组相比处于较高水平，进一步证明PCPA失眠能导致前额叶皮质ATP水平下降。本研究提示，SZRD对大脑皮质ATP的作用只发生在PCPA所致失眠后，其具体机制还有待进一步阐明。

SZRD是《金匮要略》中治疗失眠的经典方剂，疗效确切，至今临床仍广泛应用，SZRD对前额皮质ATP作用可能是其发挥治疗睡眠障碍的环节之一，本实验为SZRD治疗失眠的机制研究提供了实验依据。

[1]王慧，罗坤，武静．酸枣仁汤对失眠大鼠中脑中缝背核神经胶质细胞的影响[J]．中国实验方剂学杂志，2012，21(21)：235-239．

[2]Dworak M,Mccarley RW,Kim T,et al.Sleep and brain energy levels:ATP changes during sleep[J].J Neurosci,2010,30(26):9007-9016.

[3]朱国庆，怅慧秀，王敏,等.侧脑室注射cAMP和ATP对大鼠睡眠的影响[J]．安徽医科大学学报，1993，82(3)：171-172．

[4]Jerome YY,Robert MB,Robert CV.Cerebral energy metabolism during hypoxic ischemia and early recovery in immature rats[J].Am J Physiol,1992,65(2):672-677.

[5]Burnstock G.Purinergic co-transmission[J].Exp Physiol,2009,94(1):20-24.

[6]Burnstock G,Krügel U,Abbracchio MP,et al.Purinergic signalling:from normal behaviour to pathological brain function[J].Prog Neurobiol,2011,95(2):229-274.

[7]Chikahisa S,Séi H.The role of ATP in sleep regulation[J]Front Neurol,2011,2(2):1-5.

[8]何华香，赵仓焕，陆雪,等.中医中药对PCPA致失眠大鼠脾脏HPA轴相关单胺类神经递质及激素影响的研究进展[J]．暨南大学学报(自然科学与医学版)，2015，36(2)：155-159．

[9]许晓伍，陈群，马春媚,等.PCPA致大鼠失眠后不同时间点神经元线粒体形态和功能的变化[J]．解剖学研究，2014，36(1)：34-38．

[10]许晓伍.基于线粒体途径探讨安寐汤抑制失眠大鼠皮质神经元兴奋机制[D].广州：广州中医药大学,2013.

[11]史琴,王慧,武静.PCPA失眠后大鼠不同时间大脑皮质钠-钾ATP酶和钙-镁ATP酶活性变化及酸枣仁汤的干预作用[J]．时珍国医国药，2016，26(5)：1050-1052．

[12]胡晓辉,李柱一.PCPA 致失眠模型大鼠中缝背核 galanin阳性神经元的表达与 5-HT 关系的研究[D].北京:中国人民解放军第四军医大学,2010.

[13]杨俊华.星形胶质细胞来源的ATP促进丘脑中的突触删除[D].杭州：浙江大学，2015.

[14]Lalo U,Palygin O,Rasooli-Nejad S,et al.Exocytosis of ATP from astrocytes modulates phasic and tonic inhibition in the neocortex[J].PLoS Biol,2014,12(4):e1001857.

Changes in prefrontal cortex ATP concentration over time after PCPA induced insomnia and the intervention effect of Suanzaoren decoction*

WuJing1,WangHui2△,ShiQin3,ZangYingzhu4

(1.DepartmentofAnatomy;2.FunctionalLaboratory;3.DepartmentofPhysiology;4.GraduatSchool,GuiyangCollegeofTCM,Guizhou,Guiyang550025,China)

adenosine triphosphate;fenclonine;sleep initiation and maintenance disorders;insomnia;prefrontal cortex

国家自然科学基金资助项目(81360590)。 作者简介：武静(1981-)，硕士，讲师，主要从事中西医结合基础研究。△

，E-mail:wanghsky@126.com。

R2-031

A

1671-8348(2017)04-0439-03

2016-09-10

2016-10-18)