赵 倩，陈玉春，高绪娜，郭婷婷，谷 巍

（山东宝来利来生物工程股份有限公司，山东泰安271000）

水产养殖

不同益生菌发酵中草药对鲤鱼生长性能及抗感染能力的研究

赵 倩，陈玉春，高绪娜，郭婷婷，谷 巍

（山东宝来利来生物工程股份有限公司，山东泰安271000）

为研究不同益生菌发酵中草药对鲤鱼生长性能及抗感染能力的影响，本试验选用初始体重为（11.0±1.0）g的鲤鱼450尾，随机分为5组，每组30尾，设3个重复。Ⅰ组为对照组，饲喂基础日粮；Ⅱ组为中草药复方组；Ⅲ组为产朊假丝酵母发酵中草药组；Ⅳ组为枯草芽孢杆菌发酵中草药组；Ⅴ组为鼠李糖乳杆菌发酵中草药组。养殖56 d后，测定其生长指标，并腹腔注射嗜水气单胞菌进行感染试验，统计死亡率。同时采用硫酸-苯酚法测定中草药发酵前后多糖含量。结果表明：（1）与Ⅰ组相比，Ⅲ组、Ⅳ组增重率分别提高22.55%、14.29%（P＜0.05），特定生长率分别提高13.53%、8.8%（P＜0.05），饲料系数分别降低22.48%、14.59%（P＜0.05），肥满度分别提高13.53%、9.1%（P＜0.05），肾脏指数分别提高12.24%、12.24%（P＜0.05）；（2）Ⅲ组脾脏指数较Ⅰ组提高16.51%（P＜0.05），各组间肝脏指数、存活率差异均不显著（P＞0.05）；（3）Ⅳ组死亡率分别较Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅴ组降低56.41%、54.05%、45.16%、45.16%（P＜0.05），Ⅲ组、Ⅴ组死亡率较Ⅰ组、Ⅱ组分别降低20.51%、16.21%（P＜0.05）；（4）发酵48 h后，Ⅲ组、Ⅳ组多糖含量分别比对照组增加71.88%、46.09%（P＜0.05），分别比Ⅴ组增加78.99%、52.12%（P＜0.05）。由此可见，发酵中草药的最佳菌株为枯草芽孢杆菌，发酵中草药多糖含量显著增加，且提高了鲤鱼的生长性能及抗感染能力。

发酵中草药；多糖含量；鲤鱼；生长性能；抗感染

中草药和益生菌制剂作为饲料添加剂，具有纯天然、无毒害、无药残、安全方便、功能全面等优点，已成为国内外研究的热点。中草药富含多糖、生物碱、甙类、有机酸、挥发油等活性物质，因此在促进生长，改善鱼体品质，提高非特异性免疫力和饲料利用率，抵抗病原菌感染等方面均有良好效果（李霞，2011;冷向军，2008）。益生菌制剂可以提高生产性能、维持肠道菌群平衡、增强免疫力和防治疾病（于莲等，2012）。中草药益生菌发酵制剂是中草药和益生菌两者的结合，具有促进动物生长发育、降低饲料系数、增强药效和降低饲养成本等作用（兰时乐等，2010）。

本试验旨在研究不同益生菌发酵对中草药复方多糖含量的变化，并探讨发酵中草药对鲤鱼生长性能及对嗜水气单胞菌抗感染能力的影响，为益生菌发酵中草药在水产养殖中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验中草药 黄芪、甘草、板蓝根、枸杞等均购自泰安市漱玉平民大药房。

1.1.2 试验菌株 产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌、鼠李糖乳杆菌由山东宝来利来生物工程股份有限公司菌种保藏中心提供；嗜水气单胞菌由山东农业大学提供。

1.1.3 培养基 酵母菌液体培养基：葡萄糖2%、酵母膏0.5%、蛋白胨1.0%、磷酸二氢钾0.2%，pH自然。

芽孢菌液体培养基：葡萄糖0.2%、蛋白胨1.0%、氯化钠0.5%、酵母膏0.5%，pH 7.0。

乳酸菌液体培养基（MRS）：葡萄糖2.0%、柠檬酸铵0.2%、乙酸钠0.5%、磷酸氢二钾0.5%、硫酸锰0.02%、硫酸镁0.05%、蛋白胨1.0%、牛肉膏1.0%、酵母膏0.5%、吐温-80 0.1%，pH 6.0。

嗜水气单胞菌液体培养基：蛋白胨1%、牛肉膏0.3%、氯化钠0.5%，pH 7.4。

1.1.4 发酵液的制备 配制酵母菌、芽孢杆菌、乳酸菌液体培养基，斜面挑取3种菌株分别接种于液体培养基中活化，制备新鲜的种子液，采用平板法进行活菌计数后，于4℃冷藏备用。

称取中草药复方5 g，置于含50 mL蒸馏水的250 mL三角瓶中，121℃灭菌30 min，冷却至室温。将3种菌液用冷冻离心机4℃、4000 r/min离心10 min，弃去上清，用灭菌生理盐水洗涤三次，洗涤后的菌泥用一定比例生理盐水稀释后接种至中草药复方中（2%接种量，活菌数为1×108cfu/mL），37℃振荡发酵24 h。每组3个平行，分4个组，分别为中草药复方组、产朊假丝酵母发酵组、枯草芽孢杆菌发酵组、鼠李糖乳杆菌发酵组，依次设为1、2、3、4组。

1.1.5 发酵中草药饵料的制作 将中草药复方药液、产朊假丝酵母中草药发酵液、枯草芽孢杆菌中草药发酵液、鼠李糖乳杆菌中草药发酵液，按0.2%的药量分别添加到鲤鱼基础日粮中，基础饲料组成及营养水平见表1。用小型饲料机制备颗粒饲料，饲料粒径为1.5 mm。

表1 基础饲料组成及营养水平（风干基础）%

1.2 试验动物饲养 试验用鲤鱼购自泰安温泉鱼苗厂，选取健康、初始均重为（11.0±1.0）g的鲤鱼450尾，随机分为5组，每组3个重复，每个重复30尾鱼，预饲14 d。Ⅰ组为对照组，饲喂基础日粮；Ⅱ组为中草药复方组；Ⅲ组为产朊假丝酵母发酵中草药组；Ⅳ组为枯草芽孢杆菌发酵中草药组；Ⅴ组为鼠李糖乳杆菌发酵中草药组。试验用鲤鱼饲养于室内玻璃水族箱（1 m×0.6 m×0.5 m）中，有效水体积220 L。将充分曝气除氯自来水作为循环水源，水温控制在（24±1）℃，24 h持续充氧；日投喂量为每组鱼总重的1.5%，早、中、晚定时投喂。试验周期为8周。

1.3 多糖含量测定方法

1.3.1 标准品溶液的制备 精确称取105℃干燥至恒重的无水葡萄糖标准品10.30 mg，加蒸馏水定容至100 mL，摇匀，即得0.103 mg/mL的葡萄糖标准品溶液。

1.3.2 供试品溶液的制备 取4组3个平行的12个样品，每个样品含中草药5000 mg（M），水50 mL（V1），4000 r/min离心10 min，吸取上清1.0 mL （V2），分别置于10 mL具塞试管中，加入10 mL无水乙醇，4℃放置12 h沉淀多糖，4000 r/min离心10 min，弃去上清液，多糖用无水乙醇洗涤3次后，加水溶解，定容至50 mL（V3），摇匀，待测。

1.3.3 标准曲线的绘制 精确吸取葡萄糖标准品溶液0.0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mL，分别置于10 mL具塞试管中，加入蒸馏水至终体积为1.0 mL，然后各加入5%苯酚溶液1.0 mL，振荡混匀，再加入5.0 mL浓硫酸，混匀后放置10 min，于40℃水浴中保温15 min，取出后冷却至室温，在最大吸收波长490 nm处测定吸光度（A）。

1.3.4 样品中多糖的测定 样品溶液根据浓度摸索稀释倍数（B）后，精确吸取1.0 mL（V4）置于10 mL具塞试管中，以下操作同1.3.3，依法测定吸光度，计算多糖含量。

式中：m为从标准曲线上查得多糖含量，mg；M为试样质量，mg；V1为样品制备时定容的体积，mL；V2为样品处理时吸取体积，mL；V3为样品处理时定容的体积，mL；V4为样品测定时吸取的体积，mL；B为样品溶液稀释倍数。

1.4 样品采集及指标测定

1.4.1 样品采集与制备 饲养试验结束24 h后，统计每组存活尾数，称量体重和测量体长。每个重复随机取3尾，每组取9尾鱼，剖开腹部，剥离出脾脏、肾脏、肝脏并称重。

1.4.2 生长指标的测定

增重率 （WGR）/%=[（末均重-初均重）/初均重]×100；

饲料系数（FCR）=摄食量/（终末总体重-初始总体重）；

肥满度（CF）/%=（试验末鱼体重/试验末鱼体长3）×100；

特定生长率 （SGR）/%/d=100×（ln终末均重-ln初始均重）/养殖天数；

肝脏指数（HSI）/%=肝胰脏重/体重×100；

肾脏指数（RI）/%=肾脏重/体重×100；

脾脏指数（SI）/%=脾脏重/全鱼重×100。

1.4.3 对嗜水气单胞菌的抗感染能力试验 饲喂试验结束后采用嗜水气单胞菌 （1×108cfu/mL）对试验鱼进行攻毒。每组3个平行，每个平行15尾鱼，每尾腹腔注射0.1 mL嗜水气单胞菌菌悬液。饲养观察1周后，统计各组的死亡率。

死亡率/%=（死亡鱼体尾数／试验初鱼体尾数）×100。

1.5 数据统计分析 试验数据采用 “平均值±标准差”表示，用SPSS 17.0软件对数据作单因素方差分析 （ANOVA），若处理组间差异显著，再用Duncan’s进行多重比较，显著性水平为0.05。

2 结果与分析

2.1 不同益生菌发酵对中草药复方多糖含量的影响 由表2可知，发酵24 h后，2、3组多糖含量比1组增加33.71%、12.69%（P＜0.05），比4组增加40.29%、18.22%（P＜0.05）；发酵48 h后，2、3组多糖含量比1组增加71.88%、46.09%（P＜0.05），较4组增加78.99%、52.12%（P＜0.05），2组较3组增加17.66%；发酵72 h后，2、3组多糖含量较1组增加67.13%、57.11%（P＜0.05），比4组增加86.79%、75.59%（P＜0.05）。

表2 不同益生菌发酵中草药复方对多糖含量的影响 %

2.2 不同益生菌发酵中草药复方对鲤鱼生长指标的影响 由表3可知，Ⅲ组、Ⅳ组增重率分别比Ⅰ组提高22.55%、14.29%（P＜0.05），比Ⅱ组提高21.55%、21.45%（P＜0.05），比Ⅴ组提高18.85%、10.84%（P＜0.05）；Ⅲ组、Ⅳ组饲料系数分别比Ⅰ组降低22.48%、14.59%（P＜0.05），比Ⅱ组降低21.56%、13.73%（P＜0.05），比Ⅴ组降低17.89%、10.30%（P＜0.05）；Ⅲ组、Ⅳ组特定生长率分别比Ⅰ组提高13.53%、8.8%（P＜0.05），比Ⅱ组提高12.86%、8.19%（P＜0.05），比Ⅴ组提高11.56%、6.93%（P＜0.05）；Ⅲ组、Ⅳ组肥满度分别比Ⅰ组提高13.53%、9.1%（P＜0.05），比Ⅱ组提高16.97%、14.54%（P＜0.05），比Ⅴ组提高18.77%、16.31%（P＜0.05）；Ⅲ组脾脏指数比Ⅰ组提高16.51%（P＜0.05）；Ⅲ组、Ⅳ组肾脏指数分别比Ⅰ组提高12.24%、12.24%（P＜0.05）；各组间肝脏指数、存活率差异均不显著（P＞0.05）。

表3 不同益生菌发酵中草药复方对鲤鱼生长指标的影响

2.4 不同添加量发酵中草药对鲤鱼抗感染能力的影响 由表4可知，鲤鱼经嗜水气单胞菌感染，观察一周，Ⅳ组死亡率分别比Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅴ组降低了56.41%、54.05%、45.16%、45.16%（P＜0.05），Ⅲ组、Ⅴ组死亡率相同，比Ⅰ组、Ⅱ组分别降低了20.51%、16.21%（P＜0.05）。

表4 不同添加量发酵中草药对鲤鱼抗感染能力的影响

3 讨论

3.1 不同益生菌发酵对中草药复方多糖含量的影响 本试验采用产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌、鼠李糖乳杆菌分别发酵中草药复方（黄芪、甘草、板蓝根、枸杞等），检测不同发酵时间多糖含量的变化，结果表明，产朊假丝酵母发酵物多糖含量最高，发酵48 h可达15.59%，发酵72 h可达16.68%；其次是枯草芽孢杆菌发酵物多糖含量，发酵48 h可达13.25%，发酵72 h可达15.68%；鼠李糖乳杆菌发酵物多糖含量最低，发酵72 h只有8.93%。分析原因可能是产朊假丝酵母发酵物本身富含多糖类物质，如葡聚糖、甘露聚糖等；枯草芽孢杆菌生长代谢过程中可产生纤维素酶、果胶酶等活性酶，会破坏中草药细胞壁，有利于多糖等活性物质的析出；鼠李糖乳杆菌发酵过程会分解多糖产生乳酸等其他物质而使其多糖含量降低。范作良等（2015）将丙冬甘宁中草药方经枯草芽孢杆菌发酵52 h后，通过液相测定发现，发酵后甘草次酸、黄芩素含量升高，而甘草酸和黄芩苷含量降低。焦方文等（2016）采用硫酸-苯酚法测定3种益生菌发酵麦芽前后多糖的含量，结果表明，发酵前后多糖含量有显著差异，但不同益生菌分解多糖的能力不同，短双歧杆菌和嗜酸乳杆菌发酵后多糖含量分别为6.22%、0.71%，差异显著。赵玉萍等（2005）在鼠李糖乳杆菌培养基中加入党参多糖能够使鼠李糖乳杆菌明显增殖，缩短发酵时间，提高其耐酸、耐胆碱盐及耐高温的能力。益生菌发酵可以改变中草药的成分含量，但不同菌株发酵影响成分含量的变化不一致，因此提高或降低某种成分还需针对性的筛选菌株。

3.2 不同益生菌发酵中草药对鲤鱼生长性能的影响 本研究结果表明，在鲤鱼日粮中添加0.2%产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌中草药发酵物可以显著提高鲤鱼各项生长指标及免疫器官指数，但中草药复方组和鼠李糖乳杆菌发酵组均无显著效果。分析原因可能是中草药复方组添加量小，无法达到较好的促生长效果；鼠李糖乳杆菌在饲料制粒和放置过程中，活菌数会显著下降，无法达到调理肠道菌群、促进吸收从而影响生长的作用。谭娟等（2015）研究表明，不同浓度的鱼腥草、金银花等复方中草药均能显著提高草鱼生长性能，并且添加3%和投喂30～60 d效果更佳。Gatesoupe等（1999）对大菱鲆仔鱼和日本比目仔鱼的研究表明，芽孢杆菌能提高仔鱼的生长率。向枭等（2011）在基础日粮中添加黄芪多糖可显著提高齐口裂腹鱼的增重率、特定生长率、饲料蛋白利用效率，最佳黄芪多糖添加水平为0.045%～0.074%。谢炎福等（2015）将益生菌发酵复方中草药添加至黄河鲤饲料中，研究发现，0.3%添加量对黄河鲤具有明显的促生长作用，并且可刺激黄河鲤非特异性免疫。中草药、益生菌及多糖均有提高水产动物生长性能的作用，但添加量差别较大，中草药发酵制剂添加量明显低于中草药制剂，且效果同样显著，其可能的原因是益生菌与中草药的协同作用，既能提高多糖等有效成分，又能促进吸收增强药效。

3.3 不同益生菌发酵中草药对鲤鱼抗感染能力的影响 本试验用嗜水气单胞菌攻毒，结果表明，发酵中草药制剂可增强机体抗感染能力，显著降低鱼体死亡率，以添加枯草芽孢杆菌发酵中草药组死亡率最低为37.78%；其次是产朊假丝酵母、鼠李糖乳杆菌发酵组死亡率为68.89%，均显著低于对照组。Ramasamy等（2010）对摄食中草药后的金鱼，进行嗜水气单胞菌攻毒试验，结果显示，中草药组金鱼的死亡率与对照组相比，降低了近3倍。程远等（2014）研究饲料中添加枯草芽孢杆菌对吉富罗非鱼幼鱼免疫力和抗氧化功能的影响，结果表明，枯草芽孢杆菌组累计存活率显著提高。表明中草药和益生菌均可增强鱼体的免疫保护率从而提高养殖的成活率，两者协同作用，效果更佳。

4 结论

本试验结果表明，益生菌发酵可以改变中草药有效成分；在鲤鱼基础日粮中添加益生菌发酵中草药可显著提高其生长性能及对嗜水气单胞菌的抗感染能力，降低死亡率。并且以添加枯草芽孢杆菌发酵中草药效果最显著。

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The paper is to study the effects of different probiotics Fermented Chinese herb on growth performance and anti-infection ability in common carp.A total of 450 tail carp with initial weight of（11.0±1.0）g were randomly divided into 5 groups with 3 repetitions of 30 each.Group I was the control group，basal diet；group II was compound Chinese medicine group；group III was Candida utilis fermentation Chinese medicine group；group IV was Bacillus subtilis fermentation Chinese medicine group；and V group was Lactobacillus rhamnosus fermentation Chinese medicine group.After 56 days，the growth indexes were measured.The infection experiment was carried out by intraperitoneal injection of Aeromonas hydrophila，and calculated the death rate.The results showed that：（1）Compared with group I，the weight gain rate of group III and IV were increased by 22.55%and 14.29%（P＜0.05），specific growth rate increased by 13.53%and 8.8%（P＜0.05），feed coefficient decreased by 22.48%and 14.59%（P＜0.05），fatness increased by 13.53%and 9.1%（P＜0.05），and kidney index were increased by 12.24%and 12.24%respectively（P＜0.05）.（2）The spleen index of group III was increased by 16.51%（P＜0.05），and the difference of liver index and survival rate among the groups was no significant difference（P＞0.05）.（3）Compared with group I，II，III and V，the mortality of group IV was decreased by 56.41%，54.05%，45.16%and 45.16%respectively（P＜0.05）.Compared with group I and II，the mortality of group III and group V were decreased by 20.51%and 16.21%（P＜0.05）.（4）After fermentation for 48 h，Candida utilis and Bacillus subtilis Fermented Chinese herbal can significantly increase the content of polysaccharide.The content of polysaccharide of those were increased by 71.88%and 46.09%more than the control group（P＜0.05），and increased by 78.99%and 52.12%more than Lactobacillus rhamnosus fermentation group（P＜0.05）.Therefore，the optimal bacterial strain for fermentation of traditional Chinese medicine was Bacillus subtilis.The content of polysaccharide in fermented Chinese herbal medicine was significantly increased；the growth performance and anti-infection ability of common carp were also increased.

fermented Chinese herb；polysaccharide content；common carp；growth performance；anti-infection

S963

A

1004-3314（2017）02-0035-05

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20170209