裴 飒 宋继权 彭玮慧 欧运超

·论著·

补体C1q基因簇rs631090多态性与女性系统性红斑狼疮的相关性研究

裴 飒 宋继权 彭玮慧 欧运超

目的： 确定补体C1q基因簇单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)与中国女性人群系统性红斑狼疮(SLE)的易感性。方法： 111例女性SLE患者及120名女性正常对照者。提取样本基因组DNA后，经普通PCR扩增目的基因，采用二代测序分析C1q基因簇上三个位点(rs631090、rs292001、rs294223)的基因型及等位基因分布。在不同的遗传模式下分析三个位点基因多态性与SLE的相关性。结果： 位点rs631090(C1qB)病例组与对照组基因型频率和等位基因分布比较差异均具有统计学意义(P=0.034和P=0.008)。位点rs292001(C1qA)和rs294223(C1qB)的基因型频率及等位基因分布结果在两组间不具统计学差异(P值均大于0.05)。位点rs631090在显性遗传模型下CT/CC基因型在统计学上具有显著保护性作用(OR=0.470，95%CI=0.268-0.823，P<0.05)。rs292001和rs294223在三种遗传模型下分析均未发现相关性(P值均大于0.05)。结论： 在中国女性人群中rs631090位点SNPs与SLE相关，基因型CT/CC可能为女性SLE保护基因型。

系统性红斑狼疮； 补体； C1q； 单核苷酸基因多态性

系统性红斑狼疮(SLE)是一种典型的自身免疫性疾病，常伴自身抗体及补体系统的变化。其发病机制主要依赖基因、环境因素以及原发性和继发性免疫系统的异常等因素。世界流行病学调查显示其发病率为(7.4～159.4)/10万人，而在发病人群中患SLE女性的数量远超男性，至少为9∶1，且多见于育龄期女性。C1q是构成补体C1的重要成分，它通过协助溶解免疫复合物以及清除凋亡细胞碎片来发挥抗炎作用[1]。尽管目前关于C1q基因簇多态性与SLE之间关联的研究很少，仍然有关于C1q缺陷导致SLE发病的病例报道[2]。近年来关于补体C1q基因簇多态性与SLE基因易感性的研究报道结果不尽相同。Clq基因簇由3个基因组成：ClqA、ClqB和ClqC，我们从111例女性SLE患者C1q基因簇上选取了三个位点：rs292001(C1qA)，rs631090(ClqB)和rs294223(ClqC)。通过基因测序分析确定其单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)是否和SLE存在相关性。本次实验采用了二代测序(next—generation sequencing，NGS)中最常用的illumina测序技术，该技术的核心是边合成边测序，通过捕捉新合成的末端标记来确定DNA的序列。二代测序较一代测序其测序通量有了很大提升，且费用更低、准确率更高、速度更快[3]。

1 对象与方法

1.1 对象 病例组为女性SLE患者111例，病例收集于武汉大学中南医院与武汉大学人民医院2015年5月至2016年5月间的门诊及住院患者，平均年龄(37.02±14.76)岁。所有患者均符合1997美国风湿协会修订的SLE诊断标准。对照组120名为正常体检者，并自行检测筛查排除SLE、干燥综合征、类风湿关节炎、皮肌炎等自身免疫病，且一、二、三级亲属无SLE患者，平均年龄(42.2±15.75)岁。所有实验组与对照组的受试者均无关联。两组年龄分布差异无统计学意义(P>0.05)。本次实验通过了武汉大学中南医院伦理委员会的批准，所有的实验参与者均签署了知情同意书。采集受试者外周静脉血标本5 mL进行DNA提取和基因分型。

1.2 方法 (1)基因组DNA的提取:采集外周静脉血保存于-20℃环境下；采用血液基因组DNA提取试剂盒法(天根生化科技公司，DP318；百泰克生物技术有限公司，DP6101)提取DNA，-20℃保存。(2)PCR扩增目的基因:用于PCR的引物如下：rs292001上游引物为5＇-GCAGACCAGAAGGATCACA-3＇下游引物为5＇-TGGGCAAGTGTCTCAACC-3＇；rs631090上游引物为5＇-TAGCCCAGTAAATGTTGAGG-3＇，下游引物为5＇-TGAACCCCATGACAACCC-3＇；rs294223上游引物为5＇-CTCGAGCAGAGAGAAAGACT-3＇，下游引物为5＇-CCTCTGAGAAATGGGGACA-3＇，由武汉达邦生物科技有限公司合成。扩增条件：94℃预变性3 min，94℃变性30 s，56℃退火30 s,72℃延伸30 s，循环35次，末次72℃延伸5 min。将扩增的PCR产物于2%琼脂糖上电泳，验证扩增结果后由武汉达邦生物科技有限公司对PCR产物进行测序，一代测序验证结果见图1～3。

图1 rs631090位点，样品27(含C/T等位基因)的PCR产物测序结果

图2 rs292001，样品29(含A/G等位基因)的PCR产物测序结果

图3 rs294223，样品31(含A/G等位基因)的PCR产物测序结果

1.3 统计学方法 根据二代测序结果，利用直接计数法对基因型与等位基因频率进行统计， Hardy-Weinberg(H-W)平衡检验，两组之间基因型频率及等位基因分布差异的比较利用软件SPSS 16.0进行χ2检验。运用Logistic回归模型控制年龄的影响，在不同的遗传模式下(相加模型、显性模型、隐性模型)分析基因多态性与SLE的相关性。OR值及95%的置信区间用来评估两组基因型频率及等位基因分布之间差异的影响。P<0.05(two-sided test)为有统计学差异。

2 结果

2.1 Hardy-Weinberg平衡检验 分别对实验组、对照组进行H-W平衡检验，三个位点在实验及对照组的分布均符合H-W平衡(P>0.05)，表示本次实验选取的样本具有很好的代表性。

2.2 基因型频率、等位基因分布及三种模型下Logistic回归分析结果 rs292001、rs631090以及rs294223三个位点的基因型频率及等位基因分布见表1，三种遗传模型(相加模型、显性模型、隐性模型)下对基因型相关性的分析见表2。由统计结果可知： rs631090位点的等位基因C和T分布在实验组和对照组差异有统计学意义(P=0.008)，CC、CT、TT三种基因型在两组间的差异具有统计学意义(P=0.034)。在显性遗传模型分析下，以TT基因型为参考，基因型CT/CC可能为SLE的保护型基因型，基因型TT有增加患SLE的风险(P=0.008，OR=0.047以及95%CI=0.268～0.823)。rs292001及rs294223的等位基因和基因型频率在两组间(实验组与对照组)差异不具有统计学意义。上述两个位点分别在相加模型、显性模型、隐性模型下对基因型相关性进行分析，所示结果均无统计学意义。

表1 rs631090、rs292001和rs294223位点基因型及等位基因在病例组和对照组间的分布

表2 三个位点在三种遗传模型下的分析结果

3 讨论

补体激活可分为3条途径：经典途径、MBL途径以及旁路途径。C1q作为补体C1的一部分由18个多肽链构成即6A，6B和6C[4]，它是经典途径(classical pathway,CP)的识别分子在CP的起始阶段通过与免疫复合物、凋亡细胞、C反应蛋白等上面的配体结合来启动补体经典激活途径。

在SLE活动期，补体系统尤其是C3会沉积在各种器官的炎症部位。补体缺陷可以促进SLE的发生、发展，遗传性补体缺陷患者SLE的发病率高于正常人群[5]。目前已确证40多个与SLE易感相关的遗传因素，其中就包括补体成分缺陷(C1q，C4，C2)。研究表明，补体活化经典途径中的早期成分(C1q、C2、C4)的遗传性纯合子缺陷与SLE的发生发展及病情的严重程度有关。在SLE患者中，C1q自身抗体的产生可能会导致C1q缺陷。C1q自身抗体也是在SLE患者致病的免疫复合物中最先被发现。它被证实与狼疮肾炎(lupus nephritis,LN)有关。而LN存在于30%～50%的狼疮患者中。除ANA和dsDNA外，C1q、C3和C4以及C1q的抗体在血清中的浓度是诊断SLE很重要的免疫学指标，尤其是对于LN。在SLE中，C1q缺失可能是C1q基因缺陷所致抑或者是C1q自身抗体的产生。已被证实补体C1q和C1q抗体的浓度在活动期LN患者中会分别减少和升高。 C1q 除了参与SLE的发病，已有证实C1q在一定程度上与动脉粥样硬化、糖尿病、类风湿关节炎、精神分裂症以及衰老相关疾病如神经退行性病变、肌纤维化等相关[7-10]。Rafiq等研究欧洲人群中的23个位点认为，最有可能与SLE存在关联的位点是rs294223(P=0.06)[1]。Martens等研究荷兰北部的高加索人，103例静止期SLE患者，经系谱不平衡检验(pedigree disequilibrium test,PTD)分析得rs631090与SLE存在明显关联(P=0.02)[11]；Radanova及其同事对保加利亚人群进行研究(38例LN患者和185名健康对照)，rs631090与LN无相关性[12]。Mosaad等人在130例埃及青少年SLE患者(juvenile SLE,jsSLE)中证明位点rs292001的SNPs与jsSLE存在明显相关性，且C1q蛋白的血清水平在jSLE中明显低于对照组，治疗前后的对比结果显示在LN和肾病活动期患者中可以观察到C1q水平明显回升[13]；同样在土耳其人群中rs292001被证明SNPs与SLE存在基因易感性[1]。而且从Martens的研究中可知rs292001与重症SLE存在关联(Systemic Lupus Erythematosus International Collaborating Clinics (SLICC) damage index score>0;P=0.007)，但在波兰SLE人群中并未呈现明显关联性[11]。在保加利亚人群中亦未证明rs292001SNPs与LN存在基因易感性[12]。以上研究结果不尽相同，推测可能与地域和种群差异、实验技术以及样本量等因素相关。我们的实验中位点rs631090在病例组与对照组基因型频率和等位基因分布比较，其差异均具有统计学意义(P=0.034和P=0.008)。位点rs292001和rs294223的基因型频率及等位基因分布结果在两组间不具统计学差异(P>0.05)。位点rs631090在显性遗传模型下CT/CC基因型在统计学上具有显著保护性作用(OR=0.470，95%CI=0.268～0.823，P<0.05)。rs292001和rs294223在三种遗传模型下分析均未发现相关性(P>0.05)。rs631090位点在两组间基因型频率及等位基因分布的比较结果表现出明显差异，推测其SNPs与中国女性SLE的发病可能存在关联。而rs292001和rs294223的SNPs与中国女性SLE之间不存在基因易感相关性。

本研究主要结论如下：初步探究了C1q基因簇多态性与SLE基因易感性的关系。结果提示rs631090的单核苷酸多态性与中国女性系统性红斑狼疮易感性相关。在中国女性SLE人群中TT基因型可能增加患SLE的风险，CC/CT基因型可能提供保护作用。这为以后的机制学研究提供了新的思路。因本实验样本量较小，地域范围较窄，其结果有待更多的研究证实。

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(收稿：2016-08-25)

Association of rs631090 C1q gene cluster polymorphism with systemic lupus erythematosus among women population

PEISa,SONGJiquan,PENGWeihui,OUYunchao.

ZhongnanHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430071,China

SONGJiquan,E-mail:songjiq@126.com

Objective: To investigate the association of C1q gene cluster polymorphisms with systemic lupus erythematosus (SLE) among Chinese women population. Methods: A case-control study including 111 SLE patients and 120 healthy individuals were designed. DNA of the subjects was extracted and amplified by polymerase chain reaction (PCR). The difference in frequencies of the three single nucleotide polymorphisms (SNPs) (rs631090, rs292001 and rs294223) alleles and the genotypes were further confirmed by the next-generation sequencing technology. Results: In rs631090 (C1qB), distributions of the genotypes or alleles between case and controls were significantly different (P=0.034 andP=0.008, respectively). The differences in the frequencies of the other two SNPs (rs292001 (C1qA) and rs294223 (C1qB)) alleles and genotype were statistically insignificant when the SLE patients were compared with controls in this study (all,P>0.05). Under dominant model, the CT/CC genotypes of rs631090 showed significant protective effect on SLE (OR=0.470, 95%CI=0.268-0.823,P<0.05). About rs294223 and rs292001, no association was detected using different genetic model (additive, dominant and recessive; all,P>0.05). Conclusion: Our findings indicate that the SNPs of rs631090 might be associated with the development of SLE among Chinese women population, and the genotype CT/CC of rs631090 may be the protective genotype for SLE.

systemic lupus erythematosus (SLE); complement; C1q; single nucleotide polymorphisms (SNPs)

湖北省自然科学基金(编号：2013CFB263)

武汉大学中南医院皮肤科，湖北省武汉市，430071

宋继权，E-mail: songjiq@126.com