王 岩，刘 洋，骆 翔，邓意辉*



克里唑替尼脂质体的制备与含量测定

王 岩1,2，刘 洋1，骆 翔1，邓意辉1*

（1. 沈阳药科大学药学院，辽宁沈阳 110016；2. 沈阳市妇婴医院药剂科，辽宁沈阳，110014）

目的制备克里唑替尼（crizotinib, CIB）脂质体，并建立CIB的含量测定方法。方法采用pH梯度法制备克里唑替尼脂质体（crizotinib liposomes, CIBL），以紫外分光光度法测定脂质体中CIB的含量。结果实验条件下所用辅料对CIB的测定无干扰，CIB对照溶液的质量浓度在15.0~35.0 mg·L-1内线性关系良好，相关系数=0.999 6，回收率在99.8%~101.2%内，日内及日间精密度RSD均小于2%（=3），制得CIBL的平均包封率为90.8%±1.11%。结论 pH梯度法可用于制备CIBL；紫外分光光度法测定CIB的含量简便易行，结果准确，可用于CIBL的含量测定。

药剂学；脂质体；pH梯度法；紫外分光光度法；克里唑替尼；含量测定

克里唑替尼（crizotinib，CIB，化学结构式见图1）是包括间变性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase, ALK）和肝细胞生长因子受体c-Met在内的酪氨酸激酶受体抑制剂，其主要通过抑制细胞内ALK和c-Met的磷酸化来发挥抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡的作用[1]。由辉瑞公司研发的CIB胶囊（商品名 xalkori®）于2011年8月26日获FDA批准，用于治疗ALK阳性的局部晚期或转移非小细胞肺癌（non-small-cell lung cancer）[2]。由于CIB吸收后在组织中广泛分布，易引起视觉障碍、胃肠道等不良反应，甚至会引起部分患者出现窦性心动过缓、转氨酶异常、中性粒细胞下降和呼吸困难等严重不良反应，导致约29%~44%的患者须降低使用剂量，3%~6%的患者甚至放弃治疗[1]。脂质体具有延长药物体内循环时间、提高药物靶向性、增强疗效、降低毒性及不良反应、提高被包封药物稳定性等优点。因此考虑将CIB包裹于脂质体中，综合利用实体瘤的高渗透长滞留EPR效应及CIB的分子靶向性，达到提高疗效、降低毒性及不良反应的目的。到目前为止，国内外尚无有关克里唑替尼脂质体（crizotinib liposomes，CIBL）的研究报道。本文作者结合CIB两亲弱碱性的结构特点，采用pH梯度法制备CIBL，并采用紫外分光光度法对其含量进行测定，该法方便快捷，结果准确。

Fig. 1 Chemical structure of crizotinib

1 仪器与材料

UV5100紫外可见分光光度计（安徽皖仪科技股份有限公司），VBS124s电子分析天平（德国赛多利斯公司），DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义英峪予华仪器厂），JY92-2D超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司），PHS-25酸度计（上海精科雷磁仪器厂），离心机（Anke TDL80-2B，上海安亭科学仪器厂）。

克里唑替尼原料药（CIB, 上海盛希医药原料有限公司，纯度质量分数≥98％），氢化大豆卵磷脂（ HSPC，德国Lucas meyer cosmetics公司），胆固醇（CH，南京新百药业有限公司），聚乙二醇单甲醚2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（mPEG2000-DSPE，美国Genzyme公司），离子交换纤维（ZB-1、ZB-2型，桂林正翰科技开发有限责任公司），-苹果酸、柠檬酸、柠檬酸三钠（天津博迪化工股份有限公司），无水乙醇（徽安特生物化学有限公司)。

2 方法与结果

2.1 脂质体的制备[3]

取HSPC、CH及mPEG2000-DSPE（质量比3∶1∶1），加入适量无水乙醇，于65 ℃水浴中搅拌溶解，挥去大部分乙醇后，注入浓度为300 mmol·L-1的柠檬酸盐缓冲溶液（pH值为4.0），65 ℃水浴搅拌20 min。得到的脂质体初品经超声处理，依次通过0.80、0.45、0.22 µm的微孔滤膜进行整粒，得空白脂质体。取上述空白脂质体0.2 mL，加入阴阳离子交换纤维混合柱的顶端，2 000 r∙min-1离心4 min；另取重蒸水0.1 mL，加入纤维柱顶端，2 000 r·min-1离心4 min，重复操作3次，合并洗脱液得到具有跨膜离子梯度的空白脂质体，其中HSPC的质量浓度为20 g·L-1。

精密称取CIB 40.0 mg、苹果酸24.0 mg置于10 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得4 g·L-1CIB水溶液。

取梯度脂质体1.0 mL，按药脂质量比1∶10加入4 g·L-1CIB水溶液0.5 mL，于60 ℃水浴中搅拌孵育10 min后，加入500 mol·L-1磷酸钠溶液40 µL，调节外水相pH值至7，继续磁力搅拌15 min，冰水浴终止载药，即得克里唑替尼脂质体（crizotinib liposomes，CIBL），其中CIB的质量浓度为1.3 g·L-1。

2.2 脂质体中CIB含量测定方法的建立

2.2.1 对照溶液的配制

精密称取CIB 25.0 mg、苹果酸15.0 mg置于10 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取上述溶液1.00 mL，以体积分数为90%的异丙醇（含0.75 mol∙L-1盐酸）稀释至25 mL，得质量浓度为100 mg·L-1对照储备液。精密量取上述储备液2.50 mL，以体积分数为90%的异丙醇（含0.75 mol∙L-1盐酸）稀释至10 mL，摇匀，即得质量浓度为25.0 mg·L-1的对照溶液。

2.2.2 空白溶液的配制

精密量取空白脂质体50 μL置于10 mL量瓶中，以体积分数为90%的异丙醇（含0.75 mol∙L-1盐酸）稀释至刻度，摇匀，即得空白溶液。

2.2.3 供试溶液的配制

精密量取CIBL 0.20 mL置于10 mL量瓶中，以体积分数为90%的异丙醇（含0.75 mol∙L-1盐酸）稀释至刻度，摇匀，即得质量浓度为26.0 mg·L-1的供试溶液。

2.2.4 检测波长的选择

在波长200～500 nm内，对“2.2”条下空白溶液和对照溶液进行紫外扫描（图2），结果表明CIB分别在284 nm和336 nm处有最大吸收，且空白脂质体无干扰。由于284 nm处所测吸光度值稳定性不好，因此确定336 nm为检测波长。

2.3 线性关系考察

精密量取100 mg·L-1的CIB对照储备液1.50、2.00、2.50、3.00和3.50 mL置于10 mL量瓶中，以体积分数为90%的异丙醇（含0.75 mol∙L-1盐酸）稀释至刻度，摇匀，得质量浓度分别为15.0、20.0、25.0、30.0和35.0 mg·L-1的对照溶液，于波长336 nm处分别测定其吸光度（），得线性回归方程=1.82×10-2+1.90×10-2（= 0.999 6）。说明CIB质量浓度在15.0～35.0 mg·L-1内线性关系良好。

2.4 精密度与重复性试验

分别取“2. 3”条下质量浓度为15.0、25.0和35.0 mg·L-1的CIB对照溶液，于0、2、4、6、8和12 h进行吸光度测定。结果显示，日内精密度的RSD分别为0.80%、0.79%和0.74%；并于12、24、36、48和60 h内测定日间精密度，其RSD分别为0.85%、0.72%和0.74%。日内和日间精密度的RSD均＜2%，表明该方法精密度良好。

取CIBL适量，按“2.2.3”条方法平行制备5份供试溶液，进行测定，将吸光度值带入标准曲线，计算CIB含量的RSD为1.09%，说明方法的重复性良好。

2.5 回收率试验

精密量取100 mg·L-1的CIB对照储备液1.50、2.50和3.50 mL各3份，加入相应处方量的空白脂质体，以体积分数为90%的异丙醇（含0.75 mol∙L-1盐酸）稀释至10 mL，摇匀，配制成CIB质量浓度分别为15.0、25.0和35.0 mg·L-1的低、中、高供试溶液，测定吸光度并代人标准曲线方程得测定质量浓度，计算回收率，结果见表1。

Table 1 Results of recovery test for CIB in liposome (n=3)

2.6 脂质体中CIB的含量测定

取3批CIBL样品，按“2.2.3”条方法制备供试溶液，进行测定。另取CIB对照溶液，同法测定。按外标法计算，得3批供试品含量质量分数分别为99.86%、100.16%和100.32%。

2.7 脂质体包封率的测定

采用已建立的阳离子交换纤维分离-紫外分光光度法测定CIBL的包封率[4]，其中阳离子交换纤维对脂质体与药物溶液达到了完全分离。分别精密量取CIBL 0.20 mL 2份，一份加入重蒸水1.6 mL，以体积分数为90%的异丙醇（含0.75 mol∙L-1盐酸）溶解并稀释至10 mL，摇匀，于波长336 nm下测定吸光度并带入标准曲线方程得脂质体中CIB总质量浓度(0)。另一份置于阳离子交换纤维微柱顶端，2 000 r·min-1离心4 min，再于柱顶端加入重蒸水0.4 mL，2 000 r·min-1离心4 min，重复操作3次。将上述4次的洗脱液合并置于10 mL量瓶中，以体积分数为90%的异丙醇（含0.75 mol∙L-1盐酸）溶解并稀释至刻度，摇匀，测定吸光度，经标准曲线方程计算得脂质体中CIB总浓度(1)。包封率(%)=（1/0）×100%。测得所制备的3批CIBL的包封率分别为91.6%、91.2%和89.5%，平均包封率为90.8%±1.11%。

3 讨论

a. pH梯度载药法是在脂质体内外水相建立H+梯度，使弱碱性药物以中性的分子形式沿浓度梯度扩散进入脂质体内部，随后发生质子化并滞留在内水相。pH梯度法用于阿霉素（两亲性弱碱，pKa为8.6）脂质体的制备，使阿霉素脂质体的包封率由被动载药法的不到10%[5]提高至98%以上[6]，现已有产品（MyocetÒ）上市[7]。CIB为两亲性弱碱类药物，其pKa1为5.6、pKa2为9.4，作者采用pH梯度法制备克里唑替尼脂质体，包封率可达到90%左右。

b. 脂质体中游离药物的分离方法很多[8]，如透析法、高速离心法、葡聚糖凝胶过滤法等，但这些方法存在费用高、操作繁琐等不足。Luo等[9]采用阳离子交换纤维有效分离游离的盐酸小檗碱和脂质体，杨强等[4]采用阳离子交换纤维分离游离的表阿霉素和脂质体，并认为与传统的离子交换树脂相比，离子交换纤维具有外比表面积大、交换速度快、渗透压稳定性好等优点。因此，作者选择采用阳离子交换纤维法，达到了完全分离游离CIB与脂质体的效果。

c. 作者建立紫外分光光度法测定脂质体中CIB含量的方法。因CIB在波长336 nm有吸收峰，而空白脂质体在此波长处无吸收，对测定无干扰。而且该法具有操作简便、重现性好、结果准确等优点，为制剂的质量评价及质量控制提供了可靠依据。

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(本篇责任编辑：赵桂芝)

Preparation of crizotinib liposomes and determination of its content

WANG Yan1,2，LIU Yang1，LUO Xiang1，DENG Yi-hui1*

(1.,,110016,; 2.,110014,)

Objective Toprepare crizotinib (CIB) liposomes and establish a method for determination of its content. Methods Crizotinib liposomes were prepared by pH gradient method. Ultraviolet spectrophotometry was used to determine its content with the detection wavelength of 336 nm. Results Adjuvants used under the experiment conditions did not interfere with the determination results of CIB. CIB had a good linear relationship over the range of 15.0-35.0 mg·L-1(=0.999 6), the recovery was in a range of 99.8%-101.2%, the intra-day RSD and inter-day RSD were less than 2%（=3）. The average entrapment efficiency of CIB liposomes were 90.8% ±1.11%. Conclusions pH gradient method could be used to prepare CIB liposomes. It is a simple and accurate method to determine the content of CIB in the liposmes by ultraviolet spectrophotometry.

pharmaceutics; liposome; pH gradient; ultraviolet spectrophotometry; crizotinib; content determination

（2017）01–0008–05

10.14146/j.cnki.cjp.2017.01.002

R943

A

2015-05-28

王岩(1978-), 女(汉族), 辽宁朝阳人, 硕士研究生, E-mailwangyan992502@163.com;

邓意辉(1964-), 男(汉族), 湖南花垣人, 教授, 博士, 博士生导师, 主要从事药物靶向新剂型的研究, Tel. 024-23986316,E-mail dds-666@163.com。