孙冲+王道营��+张牧焓��+张淼��+卞欢��吴海虹��+诸永志��+耿志明��+徐为民

摘要：为了分析氧合肌红蛋白（OxyMb）的稳定性，分别采用紫外分光光度法、圆二色谱法研究在不同温度（20～60 ℃）、pH值（3.0～11.0）、盐浓度（1%～5%）条件下OxyMb的蛋白结构及稳定性。结果表明：随着温度的升高，OxyMb稳定性减弱；当温度高于40 ℃后，OxyMb的结构发生很大变化，氧化显著加剧；OxyMb在中性环境下的氧化还原稳定性最高，同时OxyMb在偏碱性环境中的氧化还原穩定性比偏酸性条件中的高；在盐浓度不太高的范围内（1%～5%），盐浓度高低对OxyMb的自动氧化没有明显影响。

关键词：氧合肌红蛋白（OxyMb）；稳定性；紫外分光光度法；圆二色谱法

中图分类号： S185；TS251.5+1文献标志码：

文章编号：1002-1302（2016）08-0360-03

肌红蛋白（myoglobin，Mb）是存在于动物肌肉组织细胞中储存氧、分配氧的色素蛋白质，由1条多肽链构成的珠蛋白（globin）、1个血红素辅基（1个卟啉环与Fe的络合物）构成。Mb的含量依赖于动物的种类、性别、年龄、营养状况、肌肉活动、氧气消耗率、血液循环、肌肉类型及肉的处理方式等[1]。在放血充分的肌肉中，Mb是色素物质的主要成分，它与肉类颜色的深浅呈正相关，因此Mb的稳定性也会影响肉色的稳定性[2-3]。肌肉中的Mb主要以氧合肌红蛋白（OxyMb）的形式存在，研究表明，许多因素会影响OxyMb的氧化，主要包括温度、高铁肌红蛋白（MetMb）还原系统活性、氧分压以及脂质氧化。高温、低pH值以及非血红素铁的存在会使OxyMb更易氧化。活体内存在的MetMb还原系统可分为酶系、非酶系，它能维持肌肉中的还原状态，并能将MetMb还原成OxyMb，使肌肉中MetMb的水平维持在2%～3%左右。宰后肉中的OxyMb逐渐发生自动氧化转变为MetMb，血红素铁被氧化，肉色发生褐变[4]。良好、正常的肉色能很好地激起消费者的购买欲望，从而较好地促进销售；相反，货架期内的变色会给肉及肉制品市场带来不可低估的负面影响。

相关研究表明，Mb氧化过程能促进脂质氧化，这一过程受很多因素影响，包括pH值、MetMb含量、血红素的结合力、铁离子的游离程度等，同时一些脂质氧化产物也能加速进肌肉中Mb的氧化和劣变[5-8]。本研究以猪肉糜中提取所得Mb为研究对象，并将其制备成OxyMb，研究离体条件下不同pH值、温度、盐度对OxyMb稳定性的影响，确定影响肉色稳定的外界因素以及稳定肉色的措施，以期为改善肉色稳定性提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料与仪器

新鲜猪肉购自当地农贸市场。无水乙醇、Tris、盐酸、硫酸铵、连二亚硫酸钠、磷酸二氢钾等均为国产分析纯。主要仪器设备有M124A万分之一分析天平、T18型高速匀浆机、UV-6100分光光度计、圆二色谱仪、K3冷冻离心机、HH-4数显恒温水浴锅、DGG-9023A型电热恒温鼓风干燥箱、KQ-300GVDV型三频恒温数控超声波清洗器。

1.2试验方法

1.2.1肌红蛋白的提取肌红蛋白的提取参考相关文献并适当改进[9-10]。取100 g肉糜与300 mL预冷的萃取介质（10 mmol/L Tris-HCl，pH值=8.5）混匀，13 000 r/min匀浆2 min；然后在4 ℃条件下于10 000×g离心15 min，吸出上清液，置于65%饱和度的硫酸铵中盐析1 h；上清液于10 000 g离心15 min，取粉红色的滤液，于-20 ℃储存待用。

1.2.2OxyMb的制备和表征利用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度后，调整浓度至2 mg/mL，立即使用。取5 mL Mb、50 mg连二亚硫酸钠反应即得氧合肌红蛋白（OxyMb）。样品中多余的连二亚硫酸钠可通过10倍体积预冷的50 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH值=7.0）透析除去，透析液换20次。将透析后的OxyMb浓度调至0.2 mg/mL。总肌红蛋白含量、OxyMb的含量根据Krzywicki的方法[11]计算，具体公式如下：

以50 mmol/L、pH值=7.0的磷酸盐缓冲液作对照，将提取的Mb、OxyMb溶液分别在350～700 nm波长处用紫外分光光度计扫描。蛋白结构采用圆二色谱仪进行表征，圆二色谱仪测试参数：参比溶液为PBS，石英比色皿厚度为1 mm，扫描范围180～320 nm，步阶为1.0 nm。

1.2.3温度对OxyMb稳定性的影响取3 mL制备的OxyMb溶液（pH值=7.0） 分别置于20、30、40、50、60 ℃水浴中加热10 min，然后将样品取出迅速浸入冰中，防止温度继续上升。再于4 000 r/min离心5 min后立即用紫外分光光度计分别扫描350～700 nm波长下的光谱，根据上述Krzywicki公式计算MetMb含量。蛋白结构采用圆二色谱仪进行表征。

1.2.4pH值对OxyMb稳定性的影响OxyMb溶液用10倍体积，pH值分别为3.0、5.0、7.0、9.0、11.0预冷 50 mmol/L 磷酸盐缓冲液透析15 h，再于4 000 r/min离心 5 min。所有的操作均在4 ℃条件下进行。取5种pH值的溶液，分别用紫外分光光度计扫描350～700 nm波长下的光谱，根据上述Krzywicki公式计算MetMb含量。采用圆二色谱仪对蛋白结构进行表征。

1.2.5盐度对OxyMb稳定性的影响在OxyMb溶液中分别加入1%、2%、3%、4%、5%氯化钠，再于4 000 r/min离心 5 min。所有操作均在4 ℃条件下进行。取5种不同盐浓度的溶液，分别用紫外分光光度计扫描350～700 nm波长下的光谱，根据上述Krzywicki公式计算MetMb含量。蛋白结构采用圆二色谱仪进行表征。

2结果与分析

2.1Mb的提取、OxyMb的制备和表征

肉糜中提取的Mb粗提液经65%硫酸铵沉淀后，得到红褐色溶液，进一步制备得到OxyMb。图1显示，Mb在412、541、574 nm处有吸收峰，OxyMb溶液在407、538、568 nm处有吸收峰[12]。圆二色谱可以用来研究Mb、OxyMb蛋白结构的变化情况。由图2可见，Mb在228 nm处有1个负峰；当加入连二亚硫酸钠制备OxyMb，在234 nm处出现1个负峰。结合光谱结果可知，OxyMb已经成功制备，蛋白结构没有发生较大改变。

2.2温度对OxyMb稳定性的影响

温度对OxyMb稳定性的影响通过紫外扫描光谱及圆二色谱可表征。由图3、图4可知：当温度为20、30、40 ℃时，OxyMb的紫外吸收光谱及圆二色谱图均表明其结构性质变化不大，但是含量逐渐降低；同时通过计算可知，高鐵肌红蛋白的生成量在20、30、40 ℃分别为（33.92±0.012）%、（3799±0.015）%、（43.86±0.013）%，逐渐提高；但在50～60 ℃时，OxyMb在350～450 nm的峰形及吸光度明显降低，

圆二色谱显示其特征吸收峰极大减弱，表明OxyMb的结构发生很大变化，蛋白变性加剧；同时通过计算高铁肌红蛋白的含量[50、60 ℃分别为（61.34±0.015）%、（66.12±0.017）%]可知，含量明显增大。这些结果是由于肌红蛋白的热稳定性受其结构影响所造成的[12-15]。

2.3pH值对OxyMb稳定性的影响

由图5、图6可见不同pH值下OxyMb稳定性的变化。OxyMb特征吸收峰由大到小排序为pH值=7.0>pH值=90>pH值=11.0>pH值=5.0，表明OxyMb在中性溶液中稳定性最高，偏碱性环境稳定性较偏酸性环境高。但是在pH值=3的溶液中，OxyMb沉淀完全，说明在极酸性的环境中血红素和球蛋白之间的共价键被破坏[16-17]。这些结果可能是由于在中性环境下，OxyMb的空间结构没有被破坏，而碱性条件下血红素解离，OxyMb结构发生改变。

2.4盐度对OxyMb稳定性的影响

在制备好的OxyMb溶液中分别加入不同NaCl，使其盐浓度分别为1%、2%、3%、4%、5%。由图7、图8可以看出：低盐度的溶液中（1%）稳定性最高；2%～5%盐浓度下，OxyMb特[CM（25]征吸收峰相差不大；通过计算可知，不同盐浓度对应高铁[CM）]

肌红蛋白的生成量[1%、2%、3%、4%、5%盐浓度分别为（20.19±0.01）%、（21.36±0.012）%、（22.64±0.011）%、（24.0±0.009 5）%、（25.09±0.014）%]也没有明显差异，说明OxyMb受盐浓度的影响不大。

3结论

研究结果表明，随着温度的升高，OxyMb稳定性减弱；当温度高于40 ℃后，OxyMb的结构发生很大变化，氧化显著加剧。可见OxyMb在中性环境下氧化还原稳定性最高；同时，OxyMb在偏碱性的环境中比偏酸性条件下的氧化稳定性要高；在盐浓度不太高的范围内（1%～5%），盐浓度的高低对OxyMb的自动氧化没有明显影响。

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