锦鲤腐皮病灭活疫苗制备及使用

2017-02-15黄博闻刘茜郜华侨张阳刘金兰

湖北农业科学 2016年20期

黄博闻+刘茜+郜华侨+张阳+刘金兰

摘要：从患有腐皮病的锦鲤（Cryprinus carpio）肝、肾、脾、血液里分离到1株优势菌，对该菌进行纯化培养并经人工感染试验，确定该菌为病原菌。经16S rRNA序列分析，鉴定该病原菌为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）。用不同浓度福尔马林和不同温度灭活蜡样芽孢杆菌，筛选其灭活效果并制得灭活疫苗。将灭活疫苗免疫健康锦鲤后测定其抗体效价变化及免疫保护率。结果表明，0.2%的福尔马林溶液在28 ℃下灭活24 h及4 ℃灭活36 h为蜡样芽胞杆菌的适宜灭活条件。首次免疫后第20天，免疫Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组血清抗蜡样芽孢杆菌的抗体效价达到高峰，分别为1∶128、1∶64、1∶64、1∶32；第30天同样剂量加强免疫后，各免疫组血清抗体效价达到更高水平，分别为1∶256、1∶256、1∶128、1∶64；免疫后第50天时攻毒，Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组免疫保护率分别为66%、66%、55%、44%。

关键词：蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）；锦鲤（Cryprinus carpio）；灭活疫苗；抗体效价；免疫保护力

中图分类号：S942.5 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）20-5320-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.20.038

Abstract： A dominant bacteria strain was isolated from the liver，kidney，spleen and blood of diseased Cryprinus carpio and confirmed as pathogenic bacteria strain by purified culture and artificial infection. It was identified as Bacillus cereusr by 16SrRNA sequence analysis. The optimal inactivated condition for preparing the inactivated vaccine of Bacillus cereusr was determined through treated with different concentrations of formalin and temperature on bacteria. The antibody titers of serum and relative percentage of survival（RPS） were determined after immune healthy Cryprinus carpi. The results showed that the optimal inactivation conditions of Bacillus cereusr were 28 ℃ for 24 h or 4 ℃ for 36 h with the concentration of 0.2% formalin. On the 20th day after the first immunization the serum antibody titer of Cryprinus carpi against Bacillus cereus reached the peak and that of immunized groupⅠ，Ⅱ，Ⅲ and Ⅳ were 1∶128，1∶64，1∶64 and 1∶32，respectively. The antibody titers of all immunized groups reached a higher level when got second immunization with the same dose as the first immunization and that of groupⅠ，Ⅱ，Ⅲ and Ⅳwere 1∶256，1∶256，1∶128 and 1∶64 on the 30th day after the first immunization，respectively. The RPS of immunized groupⅠ，Ⅱ，Ⅲ and Ⅳ were 66%，66%，55% and 44% on the 50th day after the first immunization，respectively.

Key words：Bacillus cereus； Cryprinus carpio； inactivated vaccine； antibody titres； relative percent survival（RPS）

锦鲤（Cyprinus carpio）隶属于鲤形目（Cypriniformes）鯉科（Cyprinid）鲤属（Cryprinus），为大型观赏鱼类。近年来锦鲤养殖密度越来越大，加上水质不易调控，导致锦鲤腐皮病发病率居高不下[1]，不仅影响了锦鲤的观赏价值，还易引起锦鲤大量死亡。目前从鱼类腐皮病上已分离到的致病菌有点状产气单胞菌（Aeromonas punctata Sub. punctata）、杀鲑气单胞菌（A. salmonicida）、嗜水气单胞菌（A. hydrophila）和维氏气单胞菌（A.veronii）[2-5]，对这些病原菌的抑制或杀灭多是采用抗生素类药物[6，7]，但长期使用抗生素类药物导致病原菌的耐药性问题日趋严重，同时对养殖水体也造成一定的污染。已有研究表明水产疫苗对鱼类具有良好的免疫保护效果，同时可增强鱼体抗应激能力，且符合友好环境的要求[8]。目前水产动物疫苗研制集中于大规模养殖的食用鱼疾病[2-5]，多采用注射免疫途径，给苗不便成为制约水产疫苗推广应用的关键因素[8]。而锦鲤养殖具有养殖水体小、养殖数量少、易于操作和经济价值高等特点，这些特点为疫苗的实施提供了可行性。本试验旨在通过研制锦鲤腐皮病安全有效的灭活疫苗并用于临床预防，为锦鲤腐皮病防控提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 病原菌的分离与鉴定

1.1.1 病原菌分离患病锦鲤取自北京市某锦鲤养殖场，体长15.2～18.5 cm，体重105.7～130.6 g。临床症状主要表现为病鱼躯干部和鳍基部等部位伴有充血、出血、鳞片脱落、肌肉外露等溃疡灶。在超净工作台解剖有典型病症的患病锦鲤，取病鱼的肝、脾、肾、血液组织划线接种于普通固体培养基上，28 ℃于恒温培养箱培养24 h。挑取单个优势菌落重复划线于普通固体培养基上，获得的纯化菌株保存于4 ℃冰箱备用。

1.1.2 人工感染将分离到的细菌接种于普通固体培养基上，28 ℃恒温培养24 h，用0.8%无菌生理盐水洗脱平板菌苔，制成浓度为1×108 CFU/mL的菌悬液备用。试验鱼由天津市鲤鱼良种场提供，养殖于圆形水泥池（直径为1.2 m、高1.0 m），池水预消毒曝气5 d。将20尾健康锦鲤（体重101.3～122.1 g，体长13.5～16.7 cm）分两组，每组10尾，暂养5 d后一组腹腔注射0.2 mL/尾菌悬液（1×108 CFU/mL），另一组腹腔注射无菌生理盐水（0.2 mL/尾）。饲养过程中24 h气泵增氧，三日换水量为1/3，正常投喂配合饲料，记录鱼体发病及死亡情况。取感染致死的锦鲤内脏组织和血液进行细菌再分离。

1.1.3 病原菌鉴定 16S rRNA序列分析：使用DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司）提取细菌DNA，作为PCR反应模板备用。引物为27F（5′-AGAGTTTGATCCTGG-3′）、1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）（北京生工生物工程有限公司合成）。将引物稀释至5 μmol/L，-20 ℃存储备用。PCR反应体系25 μL：正反引物各1 μL，模板2 μL， MgCl2 2 μL，dNTP 0.5 μL，PCR buffer 2.5 μL，Taq聚合酶0.3 μL，用ddH2O补足。PCR反应条件：94 ℃ 预变性5 min；94 ℃ 变性50 s；50 ℃退火50 s；72 ℃延伸2 min，35个循环；72 ℃ 延伸10 min。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测并送生工生物工程（上海）股份有限公司进行序列测定，将序列与GenBank中序列进行比对分析，用Mega 4.0软件构建系统发育树。

1.2 疫苗的制备

1.2.1 疫苗制备及条件的确定用无菌蒸馏水将福尔马林配制成梯度浓度0.2%、0.4%、1.0%、2.0%、3.0%，分别与浓度为2×109 CFU/mL的菌悬液等体积混合，每梯度设3个平行。将混合液置于28 ℃恒温摇床（80 r/min）灭活48 h；用同样方法配制福尔马林和细菌混合液置于4 ℃灭活。以上灭活过程中每12 h取0.2 mL菌液均匀涂布于普通固体培养基上28 ℃培养3 d，观察并记录是否有菌长出。将浓度为1×109 CFU/mL的菌悬液分别置于60 ℃与72 ℃恒温水浴锅热灭活12 h，每隔2 h取样检测细菌灭活情况。

将最佳灭活条件灭活的菌液4 ℃、5 000 r/min离心10 min收集菌体，生理盐水洗涤3次，并重悬菌体，使浓度约为1×109 CFU/mL与4×109 CFU/mL，4 ℃储存待用。

1.2.2 疫苗的安全性检测将待用疫苗涂布于普通固体培养基上，每组3个平行，28 ℃培养3 d，观察有无菌长出。用待用疫苗腹腔注射10尾健康锦鲤，每尾0.2 mL，持续10 d观察鱼的摄食情况、发病症状及死亡情况并记录。

1.3 锦鲤的免疫

试验锦鲤来自天津市鲤鱼良种培育场，鱼体体长12.8～17.7 cm，体重100.5～123.3 g，试验在该场水泥池中进行，正常饲喂配合饲料，24 h气泵增氧，三日换水量为1/3。试验分为免疫组与对照组，免疫组设四个处理水平，记为Ⅰ组（28 ℃条件下浓度为4×109 CFU/mL灭活疫苗组）、Ⅱ组（28 ℃条件下浓度为1×109 CFU/mL灭活疫苗组）、Ⅲ组（4 ℃条件下浓度为4×109 CFU/mL灭活疫苗组）、Ⅳ组（4 ℃条件下浓度为1×109 CFU/mL灭活疫苗组），每处理水平设3个平行，每平行各10尾锦鲤。每尾锦鲤腹腔注射0.2 mL疫苗。对照组注射0.8%无菌生理盐水，每尾0.2 mL。第一次免疫30 d后，采用相同的方法与剂量加强免疫。

1.4 抗体效价测定

采用96孔血凝板法测定血清抗体效价。首次免疫后每隔5 d从免疫组各处理水平与对照组中随机取5尾鱼，尾部静脉取血；加强免疫后每隔10 d采用相同方法采血。血样室温静置2 h，然后放置于4 ℃冰箱5 h，4 ℃条件下5 000 r/min离心10 min，收集上层血清。以浓度为4×109 CFU/mL的蜡样芽孢杆菌菌悬液為抗原检测血清抗体效价。

1.5 免疫保护率测定

首次免疫60 d后，随机从免疫组与对照组中各取10尾试验鱼，分别向腹腔注射0.2 mL的1×108 CFU/mL蜡样芽孢杆菌活菌，连续观察10 d，记录各组死亡情况，解剖检查并记录死亡鱼体表及各组织器官病变情况。按下列公式计算免疫保护率（RPS）：

免疫保护率=（对照组死亡率-试验组死亡率）/对照组死亡率×100%

2 结果与分析

2.1 病原菌鉴定

从患病锦鲤体表病灶处及实质器官中分离获得一株疑似致病菌，命名为J1。普通固体培养基上菌落为圆形、中央隆起、边缘波状、白色。细菌革兰氏染色呈阳性，长杆状，有芽孢。

通过对分离菌株J1的16S rDNA进行PCR扩增得到大小约为1 500 bp的片段，测序后得到长度为1 300 bp 16S rRNA基因序列（图1）。将获得的J1测序序列在NCBI上进行同源性比较，使用Mega 4.0软件构建系统发育树，结果表明，J1菌株与蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）聚为一类（图2）。

2.2 人工感染试验

攻毒锦鲤10尾，9尾发病，主要症状为体表黏液减少、局部充血、溃烂，发病症状与自然死亡锦鲤相同，第九天死亡率达90%，对照组没有出现临床病症及死亡，由此判断蜡样芽孢杆菌为锦鲤腐皮病的致病菌。

2.3 细菌灭活及疫苗制备

在4 ℃条件下，当福尔马林终浓度为0.1%时，需48 h完全灭活，其他浓度组在36 h内完全灭活；在28 ℃条件下，病原菌在各浓度梯度福尔马林溶液里36 h内即完全灭活，福尔马林终浓度越高，灭活所需时间越短（表1）。而在60 ℃与72 ℃条件下，灭活24 h后均有细菌存活。综合考虑福尔马林浓度和灭活时间，选择终浓度0.2%的福尔马林4 ℃灭活36 h和28 ℃灭活24 h为蜡样芽孢杆菌疫苗制备条件。

2.4 灭活疫苗安全性检测

将试验疫苗涂布于普通固体培养基上，28 ℃培养3 d后平板上无菌落生长，即判断为病原菌完全灭活。将疫苗腹腔注射健康锦鲤（0.2 mL/尾），10 d后所有鱼均存活，摄食良好，表明疫苗安全。

2.5 抗体效价与免疫保护率

以蜡样芽孢杆菌为抗原检测免疫锦鲤的血清抗体效价。结果（图3）表明，锦鲤经免疫后抗体效价水平有上升趋势。在首次免疫5 d后可以检测到抗体产生，20 d后达到高峰，Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组抗体效价分别为1∶128、1∶64、1∶64、1∶32，之后各免疫组抗体效价水平开始缓慢下降，免疫后第30天时，各免疫组抗体效价水平回落至1∶16；第30天加强免疫后免疫组血清抗体效价水平快速提升，于50 d后达到最高值，分别为1∶256、1∶256、1∶128、1∶64，60 d时抗体效价水平仍维持在较高水平，对照组均不超过1∶4。

首次免疫后第60天腹腔注射1×108 CFU/mL蜡样芽孢杆菌悬液攻毒锦鲤，对照组在攻毒第三天部分鱼体表出现黏液减少、部分组织充血、出血；第六天时出现死亡，第九天时死亡率达到90%。而免疫组在攻毒后第八天开始死亡，10 d后无继续死亡。Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组免疫保护率分别为66%、66%、55%、44%（表2）。

3 小结与讨论

蜡样芽孢杆菌广泛存在于各种环境中，是一种具有发展前景的益生菌，并在水产养殖中广泛应用[9，10]。本试验发现蜡样芽孢杆菌可引起锦鲤腐皮病，骆艺文等[11]也从患有腐皮病综合征的刺参上分离到该菌，通过人工回感试验证明其具有致病性。因此，蜡样芽孢杆菌作为益生菌在水产养殖中使用的安全性有待进一步论证。

一般认为，较温和的灭活条件，如较低的温度与较低的福尔马林浓度或较短的福尔马林作用时间，有利于抗原得到保护[12-14]。但在本试验中，4 ℃条件下使用终浓度为0.2%的福尔马林灭活36 h，抗体效价水平明显低于28 ℃条件下灭活的疫苗，这与杨先乐等[13]的报道相近。血清抗体效价和相对免疫保护力是评价疫苗免疫效果的重要参数。本试验结果表明，在适合条件下完全灭活的蜡样芽孢杆菌疫苗免疫健康锦鲤后，血清抗体效价最高达1∶256，并能持续较长时间，同时受免鱼用蜡样芽胞杆菌攻毒后，免疫保护率最高达66%，表明锦鲤对蜡样芽孢杆菌灭活疫苗能产生较强的免疫应答反应，并可有效抵挡蜡样芽孢杆菌的感染。该疫苗制备操作简单，灭活时间短，所需灭活剂浓度低，且在锦鲤上注射免疫易操作，笔者认为该灭活疫苗对锦鲤腐皮病防控具有较好的应用价值。

参考文献：

[1] 罗琳，马志宏，李铁梁.锦鲤体表溃烂病的实用防治方法[J].科学养鱼，2009（11）：53-54.

[2] 温海深，刘振琦.鲫腐皮病病原菌的初步研究[J].大连海洋大学学报，1995，10（1）：49-55.

[3] 曹红梅，刘力，沙莎，等.大西洋鲑腐皮病研究进展[J].安徽农学通报，2009，15（9）：192-193.

[4] 张伟妮，朱志华，陈志伟，等.日本鳗鲡腐皮病病原菌的分离及鉴定[J].淡水渔业，2010，40（2）：41-46.

[5] 张秋胜，陈昌福.异育银鲫对嗜水气单胞菌灭活菌苗的免疫应答[J].华中农业大学学报，2001，20（3）：271-274.

[6] 姜娜，马志宏，李铁梁，等.锦鲤溃疡病病原菌的分离及16SrRNA鉴定[J].中国畜牧兽医，2012（2）：174-177.

[7] 毛海涛，王淑雯，周颖，等.一株锦鲤致病菌的鉴定及生物学特性研究[J].水产科技情报，2015，42（1）：38-41.

[8] 王玉堂.疫苗在水产养殖病害防治中的作用及应用前景[J].中国水产，2013（3）：42-45.

[9] 张立娜，罗立新.一株产抑菌物质的蜡样芽胞杆菌的鉴定及其抑菌物质性质[J].中国酿造，2012，31（2）：99-102.

[10] 于明超，李卓佳，文国樑.芽孢杆菌在水产养殖应用中的研究进展[J].广东农业科学，2007（11）：78-81.

[11] 骆艺文，郝志凯，王印庚，等.一株引起刺参“腐皮综合征”的蜡样芽孢杆菌[J].水产科技情报，2009，36（2）：60-63.