王少净+张卫丽+刘新鑫+杜亚茹+王冰肖+李忠徽+闫宁宁+李书粉+高武军+邓传良

摘要：菠菜（Spinacia oleracea L）是研究雌雄异株植物性别分化的模式材料，其性别分化不但受到性别决定基因的控制，还受到环境条件的影响，干旱是其中的一个重要因素，但是关于聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）模拟土壤干旱环境对菠菜性别分化影响的分子机制目前尚未见报道。试验以日本大叶菠菜（S. oleracea cv. Japanese leaves）为供试材料，利用不同浓度的PEG6000进行处理，研究干旱环境对菠菜性别分化的影响。采用温室盆栽种植方式，分别用5%、10%的PEG6000模拟土壤干旱环境对盆栽菠菜处理72 h，处理株数均为100株，并同时设置对照组。结果表明，与对照组雌雄比例（0.96）相比，PEG6000 5%处理组的雌雄比例（1.09）与10%处理组（0.97）均接近于对照组；对发生性反转数进行统计，结果表明，PEG6000 10%处理组低于5%处理组；利用菠菜Y染色体紧密连锁的雄性特异标记T11A对处理前、后的植株进行鉴定，发现菠菜植株出现了性反转现象，且均为雌株转变为雄株。琼脂糖凝胶电泳结果显示，性反转后，雄性特异条带也随之出现。试验首次对PEG6000模拟土壤干旱环境对菠菜性别分化影响的分子机制进行了探究，其研究结果对于进一步揭示菠菜性别分化机理具有重要意义。

关键词：菠菜（Spinacia oleracea L）；聚乙二醇；T11A分子标记；性反转；性别分化

中图分类号：S636.1：Q344+.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）20-5275-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.20.027

Abstract： Spinacia oleracea L is the model material for studying the sex differentiation of dioecious plants. Sex differentiation of dioecious plants was controlled not only by the sex-determining gene but also affected by environmental conditions， of which drought is one of the important factors. However， the molecular mechanism of the effect of drought stress on S. oleracea sex differentiation under polyethylene glyco（PEG） treatment has not been reported. Taking S. oleracea cv. Japanese leaves as material， treating with different concentration of PEG6000， the effect of drought stress on S. oleracea gender differentiation was studied. Potting plants in greenhouse， 200 plants were treated by 5% and 10% PEG6000 respectively while the control group was treated using water. After 72 h， the male and female ratio of treated groups was compared with that of control group （0.96）. the results showed that the female-to-male ratio of 5% PEG6000 treatment （1.09） and 10% PEG6000 treatment（0.97） are close to that of the control group. The statistics showed that the sex-reversal number of 10% PEG6000 treatment was lower than that of 5% PEG6000 treatment. Using the Y chromosome linked male specific molecular markers T11A to identify the S. oleracea sex phenomenon before and after PEG6000 treatment， the results showed that the female-to-male sex reversal phenomenon happened. Agarose gel electrophoresis results showed that after female-to-male sex reversal， male specific bands also emerged. The molecular mechanism of the effect of drought stress on spinach sex differentiation under PEG6000 treatment were studied for the first time， which has great significance for further inquiry to the S. oleracea gender differentiation mechanism.

Key words： Spinacia oleracea L； polyethylene glyco； molecular markers of T11A； sex reversal； gender differentiation

菠菜（Spinacia oleracea L.）为藜科（Chenopodiaceae）菠菜属（Spinacia L.）一年生或二年生的雌雄异株植物，染色体组成为（2n=2x=12），其是研究植物雌雄异株性别分化分子机制的模式材料。性反转现象在自然界中是普遍存在的，研究表明，在干旱、养分缺乏、重金属、盐胁迫以及全球气候变化等环境胁迫下，雌雄异株植物的性别响应会出现差异[1]。这种现象在动物中也很常见，如在低等动物（如鱼、黄鳝和某些爬行动物）中由于温度等外界环境因素的改变可引起性反转[2]；在哺乳动物中同样存在性反转现象，陶志云等[3]认为哺乳动物性反转是由生殖腺及由此引起的表型性征改变而产生的，而染色体组型是不改变的。此外，郑江霞等[4]发现鸟类性别决定候选基因可以在性反转鸡胚中表达。菠菜作为雌雄异株植物，其性别分化也极易受到外界环境因素的影响[5]；然而关于外界因素对雌雄异株植物菠菜性别分化影响的分子机理目前尚不清楚。在早期研究中，Penel等[6]、曹宗巽等[5]等均发现菠菜性别差异与过氧化物酶同工酶有关。近年来，有学者通过核型分析[7，8]、性染色体显微分离[9]、同工酶技术[10]、RAPD分子标记[11，12]、EST-SSR标记[13]等方法对菠菜的性别分化进行了多角度研究。

聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）是一种渗透调节剂，常被用作植物水分胁迫剂来模拟土壤干旱环境。其原理是利用惰性的、非离子型的渗透调节剂PEG人为模拟水分渗透胁迫来进行抗旱研究，PEG自身不能通过植物细胞壁渗入活细胞内，且无活性；但能使细胞缓慢吸水[14]。由于該方法条件易控制、重复性好、周期短、操作简便，因而已应用于油菜、棉花、玉米等作物。国内外有关PEG模拟干旱环境对植物的内源激素变化、酶变化、植物生理生化反应[15]和植物种子萌发都有报道，如杨景宁等[16]及宋鑫玲等[14]分别研究了PEG对植物种子萌发的影响。此外，雌雄植株性别间对干旱胁迫的敏感性和耐受性存在明显的物种间差异[17]。目前，使用PEG对菠菜性别分化的影响未见报道。为此，试验利用PEG6000模拟干旱环境，观察在不同渗透胁迫条件下菠菜植株性别比例差异以及性反转现象，并利用菠菜Y染色体紧密连锁的雄性特异分子标记T11A对发生性反转的植株进行鉴定，以期为进一步揭示菠菜性别分化分子机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

2013-2014年，在河南师范大学植物组织培养室进行盆栽菠菜试验，品种为日本大叶菠菜（S. oleracea cv. Japanese leaves）。种植前将种子人工春化（4 ℃冰箱处理7 d左右）处理，然后播种于培养土和蛭石（1∶1.5）混合基质的花盆中，并保持湿润。培养条件为每天14～16 h光照、黑暗8～10 h的长日照，均用日光灯照明，经照度计检测，光照度为3 000 lx，室内温度控制在20 ℃，直至全部正常开花。

1.2 PEG6000处理

将种植的菠菜植株随机分为3组，PEG6000处理有2组，浓度分别为5%和10%，对照（空白）为1组，每组均为100株，并贴上相应的标签。分别利用PEG6000浓度为5%和10%的溶液对每株菠菜根部进行浇灌，每株浇约30～40 mL；对照组则正常浇水。处理后，每天定期观察菠菜植株的生长变化，并对比拍照。在试验过程中发现10%处理组处理3 d时开始出现枯萎死亡的现象，此时开始对2组处理组进行复水，随后均正常浇水，直至全部植株正常开花。由于每株植株开花时间略有差异，因此每隔2 d对菠菜开花结果情况进行一次统计，统计方法严格按照菠菜雌雄植株开花特点，并准确区分绝对雌株、绝对雄株及两性株。直至处理组和对照组菠菜均全部正常开花为止。

1.3 性反转的分子检测

为了揭示性反转的分子机制，试验进行了如下处理：在PEG6000处理之前，对培养大约2周的菠菜剪取叶片，用改良的2×CTAB法提取每株菠菜的DNA[18，19]，用菠菜Y染色体紧密连锁的雄性特异分子标记T11A[20]鉴定菠菜的原始性别，引物T11A上游序列（T11A F）为：5′-CCCTAATTAACTCCTCTTTACCCAA-3′；下游序列（T11A R）为：5′-TACAA- GCCCCATTATCATAACAGTC-3′；T11A反应体系（20 μL）为：上游引物P1 0.5 μL，下游引物P2 0.5 μL，H2O 14.4 μL，Buffer 2 μL，dNTPs 1.5 μL，Taq DNA聚合酶0.1 μL；其扩增程序为：94 ℃、2 min，94 ℃、 15 s，56 ℃、30 s，72 ℃、1 min，72 ℃、10 min，4 ℃恒温。另外，对利用PEG6000浓度为5%和10%的溶液处理后菠菜植株开花情况进行性别统计，将统计的结果与处理前鉴定的菠菜原始性别进行比较，找出发生性反转的植株，保存叶片，提取DNA，并再次利用T11A对性反转植株进行鉴定，借助琼脂糖凝胶电泳方法检测处理前后的条带变化情况。

2 结果与分析

2.1 PEG6000处理对菠菜性别分化的影响

试验对3个处理组菠菜植株开花的统计分析情况见表1。从表1可见，与对照组雌雄比例（0.96）相比，5%处理组（1.09）与10%处理组（0.97）的雌雄比例均接近于对照组，表明PEG6000处理对性别比例影响不大。与处理前菠菜原始性别相比较，发现PEG6000处理可以导致菠菜植株发生性反转，其中10%处理组的性反转比例低于5%处理组。

2.2 性反转的分子检测

利用菠菜Y染色体紧密连锁的雄性特异分子标记T11A对PEG6000溶液2个浓度处理前、后的植株进行鉴定，琼脂糖凝胶电泳结果分别见图1、图2。从图1、图2可见，PEG6000处理的菠菜植株出现了性反转现象，且均为雌株转变为雄株。性反转后，雄性特异条带也随之出现。

3 讨论

菠菜性别分化不但受到性别决定基因的控制，还受到外界环境影响。在早期研究中，Chailkhyan等[21]认为在长日照类型的菠菜中，GA3对性别表现的影响为促进雄性化，Gizawy等[22]、Sherry等[23]也都认为GA3处理有促雄作用；而曹宗巽等[5]则报道GA3在菠菜中有促雌作用。干旱作为一种重要的环境影响因子，对菠菜性别分化的影响还未见相关报道。PEG作为一种高分子渗透调节剂或水分胁迫剂，可以降低水势，添加在栽培菠菜的土壤中能够模拟干旱环境。从试验结果来看，PEG渗透溶液对菠菜植株性别分化产生了一定程度的影响，但不同浓度PEG处理对菠菜性别分化产生的影响差异不大，只是均可以产生性反转现象。

试验结果表明，PEG模拟土壤干旱环境作为一种诱导信号更有利于使菠菜由雌株向雄株方向转化。利用菠菜Y染色体紧密连锁的雄性特异分子标记T11A对处理前后的基因組进行检测表明，在雌性植株转变为雄株的过程中，雄性特异条带随之出现。菠菜性别反转的机制可能是PEG6000为一种诱导信号，菠菜细胞表面具有信号受体蛋白，信号受体蛋白在接受信号后，作为一种反式作用因子，激活了菠菜性别决定基因Y的表达，从而使得菠菜由雌株转变为雄株。因此，T11A分子标记作为Y染色体紧密连锁雄性特异标记，可以作为鉴别菠菜性别的非常稳定的标记[20]。在后期研究过程中，可以利用抑制性消减杂交技术对PEG处理前、后基因组的表达差异进行比较，从而探讨处理后性别相关基因是否完全表达。

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