张聪芝，张龙云，李燕荣，蒲春

(江苏洋河酒厂股份有限公司，江苏宿迁223800)

绵柔型白酒酿造用功能性细菌代谢典型风味化合物研究

张聪芝，张龙云，李燕荣，蒲春

(江苏洋河酒厂股份有限公司，江苏宿迁223800)

研究了绵柔型白酒酿造用功能性细菌风味化合物的代谢情况。确立了不同菌株代谢不同风味化合物优势性能；并通过优化配方组合研究，建立了典型菌株混合发酵代谢典型风味化合物的最佳配比组合；进一步对比分析不同比例及不同发酵形式下的代谢产物的含量，明确了优化组合混合发酵在代谢四甲基吡嗪等典型化合物方面的优势。

绵柔型白酒；功能性细菌；风味化合物；四甲基吡嗪

以洋河蓝色经典系列白酒为代表的绵柔型白酒逐渐受到消费者的青睐[1-2]，绵柔型白酒酿造用功能性细菌是绵柔型调味酒酿造的关键，是绵柔型白酒风格形成的基础。绵柔型白酒酿造用功能性细菌是经过定向选育的酿酒有益功能微生物，通过运用现代生物工程技术及设备用于酿酒生产[3-4]。一方面功能性细菌为嗜热芽孢杆菌，能够代谢产生以四甲基吡嗪、愈创木酚、4-乙烯基愈创木酚等为主的典型风味化合物，四甲基吡嗪等典型化合物能够为酒体提供焦香、烘烤香等坚果香气[5]；同时，嗜热芽孢杆菌代谢的酶系在高温下能够进一步推动美拉德反应进程，促进了芝麻香香气成分及前驱物质的形成[6]。顶空固相微萃取-气质联用（HS-SPME-GC-MS）是近几年发展起来的测定大曲、酒醅、发酵液风味物质的方法，相比传统风味物质的提取、测定，具有快速、高效、无溶剂挥发等特点[7]。本研究利用顶空固相微萃取-气质联用的方法，对本公司生产用12株功能性细菌风味化合物形成情况进行了定性定量分析，确定了不同菌株代谢典型风味化合物的优势；同时通过优化组合确定了代谢以四甲基吡嗪为主的典型化合物的最佳组合；通过风味化合物代谢的研究确定了功能性细菌代谢风味化合物的优势，为促进制曲工艺的提升及进一步提高调味酒质量奠定了基础，同时为绵柔型白酒生产及风格的形成奠定了基础[8-9]。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

菌株：实验菌株为枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、环状芽孢杆菌等，均为本公司筛选并保藏的菌株。

试剂：葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、无机盐、氢氧化钠、氯化钠等；仪器：PHS-3E台式pH计，LDZH-200KBS立式灭菌锅，DNP-9162A电热恒温培养箱，岛津气质联用仪，HW-150C温控振荡培养箱，90-3恒温双向磁力搅拌器。

培养基：细菌平板及斜面培养基为牛肉膏、蛋白胨培养基；细菌种子培养基为葡萄糖、蛋白胨等培养基；细菌麸曲培养基为麸皮添加适量无机盐培养基；种子培养基的灭菌条件为：121℃，灭菌20m in；发酵培养基灭菌条件为温度121℃，灭菌20m in。

1.2 实验方法

培养方法：细菌液体三角瓶种子培养方法：装液量300m L/500m L三角瓶，取1环新鲜细菌于培养基中，置于特定条件下摇床培养。在1000m L三角瓶中进行固态麸曲培养；绵柔型生产用细菌曲采用现代化圆盘制曲设备进行控温、通风、搅拌发酵培养；定期取样检测[3]。

分析方法：pH值采用全自动pH计测定；微量风味物质采用顶空固相微萃取联合气质联用（HS-SPME-GCMS）进行定性定量分析[7]。

2 结果与讨论

2.1 功能性细菌三角瓶固态发酵风味物质定性定量分析

2.1.1 功能性细菌固态发酵风味物质定性分析

通过纯种液态培养功能性细菌种子液，然后接种到固态麸皮培养基中进行单菌种固态发酵，研究单个功能性细菌风味物质形成情况；运用顶空固相微萃取-气质联用的方法进行定性分析。

图1 代表菌株146#吡嗪类化合物气相色谱图

经过分析可知，功能性细菌定性到的化合物数量和种类都较多，既有相同又有独特的风味化合物：12株功能性细菌分别定性到30种、20种、30种、24种、27种、28种、28种、17种、27种、29种、38种、31种含量较多的风味化合物，风味化合物数量最多的是151#菌；功能性细菌代谢风味化合物主要集中在醛类、酮类、吡嗪类化合物、多元醇、烯醇类、芳香族化合物、呋喃类化合物及其他杂环化合物等，还有少量的酸类、酯类、噻唑、噻吩、吡啶、吡咯化合物；其中定性到较多的吡嗪类化合物，主要有三甲基吡嗪、四甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2,4-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2，3，5-三甲基-6-乙基吡嗪、2-乙基-3，5-二甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪（图1）等，其中四甲基吡嗪可以赋予酒体焙烤香气和焦香味；并且定性到吡嗪类化合物的前体2,3-丁二醇、3-羟基-2-丁酮（醋酉翁）等化合物，2,3-丁二醇在3#和152#菌株中定性到；3-羟基-2-丁酮（醋酉翁）在1#、3#、35#、102#、109#、139#、150#和152#8株菌中定性到，2,3-丁二醇和其他多元醇在酒中起助香作用，能增加绵、甜、柔软、细腻感[8]，3-羟基-2-丁酮（醋酉翁）可以增加酒的悠长后味，嗜热芽孢杆菌可以代谢这些物质形成吡嗪类化合物；芳香族化合物中苯酚、β-苯乙醇、愈创木酚（2-甲氧基苯酚）、4-乙烯基愈创木酚等含量较高。

2.1.2 功能性细菌固态发酵典型风味物质定量分析

通过运用内标法计算，进一步对几种典型风味化合物含量进行定量分析，结果见表1、图2。

表1 功能性细菌典型风味化合物含量

图2 代表菌株139#菌风味化合物气相色谱图

由表1可知，吡嗪类化合物中四甲基吡嗪和三甲基吡嗪在各菌株中产量相对丰富，四甲基吡嗪产量最高的是139#菌，为23.45×10-10g/g，其次是3#菌，为20.54×10-10g/g，146#菌为20.13×10-10g/g，109#菌为19.99×10-10g/g；β-苯乙醇在12株菌中均定性定量检测到，其中151#菌产量最高，为1.26×10-10g/g，3#菌为0.66×10-10g/g，35#菌为0.54× 10-10g/g；愈创木酚产量最高的是146#菌，为11.04×10-10g/g，其次是109#菌，为2.96×10-10g/g；4-乙烯基愈创木酚产量最高的是146#菌，为44.86×10-10g/g，其次是139#菌，为35.28×10-10g/g。β-苯乙醇具有浓郁的水果和蜂蜜的香气，能够赋予酒体自然发酵的香气，愈创木酚、4-乙烯基愈创木酚则可以提供较多的坚果类香气，赋予酒体成熟的焦香、酱香，可以赋予调味酒较多的复合感、幽雅感。

2.2 功能性细菌三角瓶固态发酵典型风味物质配方组合研究

通过以上定性定量的综合分析，鉴于139#、146#高产四甲基吡嗪及3#高产三甲基吡嗪的性能，151#高产β-苯乙醇性能，基于通过增加139#、3#、146#菌株比例提高四甲基吡嗪含量，增加146#、139#菌比例，提高4-乙烯基愈创木酚含量，增加151#比例，提高β-苯乙醇含量，增加152#比例，提高2,3-丁二醇含量，结合前期1#、109#、151#等发酵性能的优势，选取1#、3#、109#、139#、146#、151#进行优化配方组合研究。

2.2.1 功能性细菌三角瓶固态发酵典型风味物质配方组合设计

首先纯种培养各株菌种子液，按照配方优化组合（表2）方案，按比例接种到三角瓶固态发酵培养基进行发酵，探寻功能微生物代谢以四甲基吡嗪为主，三甲基吡嗪、愈创木酚等典型风味物质的最佳组合，分别对混合发酵结束的功能性细菌麸曲的四甲基吡嗪、三甲基吡嗪含量等典型风味化合物指标进行测定，结果见表3。

表2 配方组合研究设计

由表3可知，三甲基吡嗪产量最高的组合是组合5，为1.67×10-10g/g，四甲基吡嗪产量最高的组合是组合8，为3.49×10-10g/g，愈创木酚、4-乙烯基愈创木酚产量最高的组合是组合2，为4.51×10-10g/g；其中组合8（1#∶3#∶109#∶139#∶146#∶151#=6∶36∶1∶11∶21∶26）在代谢四甲基吡嗪方面最为有利，四甲基吡嗪可以赋予酒体焙烤香气和焦香，选取优化组合8并进行比例化整（即比例A，1#∶3#∶139#∶146#∶151#=10∶35∶25∶20∶10），确定选取1#、3#、139#、146#、151#共5株菌进一步进行典型风味化合物混合发酵研究。

表3 功能性细菌10种组合典型风味化合物含量

2.2.2 功能性细菌三角瓶配方组合发酵典型风味物质验证分析

通过功能性细菌单菌株发酵及配方组合混合发酵确定了在代谢典型风味物质方面的特征，现通过对比研究3种比例混合发酵在代谢四甲基吡嗪等典型风味物质方面的性能，即比例A：经过化整的优化组合8（即5株强化细菌组合1#∶3#∶139#∶146#∶151#=10∶35∶25∶20∶10）；比例B：10株细菌（1#、2#、3#、4#、35#、102#、109#、139#、146#、149#）等比例；比例C：5株强化细菌组合（1#∶3#∶139#∶146#∶151#=10∶35∶25∶20∶10）与7株细菌9∶1混合发酵；发酵结束运用顶空固相微萃取联合气质联用仪测定典型风味化合物含量，结果见表4。

表4 A/B/C 3种不同比例细菌麸曲典型风味化合物比对

由表4可知，比例A在四甲基吡嗪代谢方面具有非常强的优势性能，48 h代谢产量达到130.85×10-10g/g，即化整后的组合8中的5株菌以比例A（1#∶3#∶139#∶146#∶151#=10∶35∶25∶20∶10）进行的固态混合发酵，代谢四甲基吡嗪方面确实具有优势性能，与2.2中趋势具有一致性，但是其产量的37倍多，同时4-乙烯基愈创木酚含量达到68.94×10-10g/g。

2.3 不同发酵条件下功能性细菌典型风味物质综合分析

对功能性细菌纯种发酵、配方组合混合发酵、强化菌株混合发酵，及实际生产中的细菌曲、混合曲气质联用检测的典型风味物质进行综合分析，结果见表5。

表5 不同形式下功能性细菌风味物质含量

由表5可知，就典型性风味化合物四甲基吡嗪而言，单株细菌固态麸曲发酵139#菌代谢四甲基吡嗪能力在12株菌中最强，为23.45×10-10g/g，进行配方组合优化时四甲基吡嗪含量最高的是组合8（即1#∶3#∶109#∶139#∶146#∶151#=6∶36∶1∶11∶21∶26），四甲基吡嗪产量达到3.49×10-10g/g，低于纯种发酵条件下139#的产量，说明功能性细菌之间的交互作用影响典型风味化合物的代谢，但是在比例A即5株菌（1#∶3#∶139#∶146#∶151#=10∶35∶25∶20∶10）混合发酵时四甲基吡嗪产量达到130.85×10-10g/g，是纯种139#菌发酵的6倍，是6株菌混合发酵即组合8的40倍，说明适宜菌种与适宜比例的混合发酵对代谢四甲基吡嗪方面具有一定优势，同时也可以说明109#菌对混合发酵的四甲基吡嗪代谢具有一定的抑制作用；并且比例A混合发酵情况下其他典型风味化合物的含量如三甲基吡嗪、愈创木酚、4-乙烯基愈创木酚都达到了最高水平。实际生产中的细菌曲（1#、2#、3#、4#、35#、102#、109#、139#、146#、149#等比例）四甲基吡嗪产量达到51.33×10-10g/g，而实验室条件下（1#、2#、3#、4#、35#、102#、109#、139#、146#、149#等比例）四甲基吡嗪产量高达113.75×10-10g/g（表4），后者是前者的2.2倍，说明实际生产中和实验室条件下四甲基吡嗪产量差距较大，同样的菌种、同样的比例在实际生产中由于生产的不可控因素影响了四甲基吡嗪等风味物质的代谢；同时，实际生产中的混合曲四甲基吡嗪产量为7.60×10-10g/g，是实际生产条件下细菌曲的1/6.8倍，与复混比例基本具有一致性。

3 结论

本实验研究了绵柔型白酒酿造用功能性细菌风味化合物代谢情况：首先，通过对12株功能性细菌单菌株固态发酵产风味化合物的定性定量分析可知，功能性细菌代谢产生的风味化合物数量和种类非常丰富，主要集中在醛类、酮类、吡嗪类化合物、多元醇、烯醇类、芳香族化合物、呋喃类化合物及其他杂环化合物等，还有少量的酸类、酯类、噻唑、噻吩、吡啶、吡咯化合物；其中吡嗪类化合物主要有三甲基吡嗪、四甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2, 4-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2，3，5-三甲基-6-乙基吡嗪、2-乙基-3，5-二甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪等，其中139#菌代谢四甲基吡嗪能力在12株菌中最强，为23.45×10-10g/g，确立了不同菌株代谢不同风味化合物优势性能；其次，通过对选取的6株优势菌株进行混合发酵配方组合研究以及不同比例情况下的对比验证，确定了比例A即5株菌（1#∶3#∶139#∶146#∶151#=10∶35∶25∶20∶10）混合发酵时四甲基吡嗪产量最高，为130.85×10-10g/g，4-乙烯基愈创木酚达到68.94（×10-10g/g），建立了典型菌株混合发酵代谢典型风味化合物的最佳配比组合；进一步通过对不同发酵条件下功能性细菌典型风味物质综合分析可知，适宜菌种适宜比例的混合发酵在代谢四甲基吡嗪等典型风味化合物方面具有一定优势，比例A代谢三甲基吡嗪、四甲基吡嗪、愈创木酚、4-乙烯基愈创木酚以及β-苯乙醇均达到了最高水平，建立了典型菌株混合发酵代谢典型风味化合物的最佳配比组合。

通过本研究确定了功能性细菌在纯种发酵和组合发酵代谢以四甲基吡嗪为主的典型风味化合物的优势，为促进绵柔型白酒酿造用复合功能曲制曲工艺的提升及改进奠定了基础，对绵柔型白酒调味酒及绵柔型白酒生产具有重要意义。

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Metabolites of Functional Bacteria for Soft-Flavor Baijiu Production

ZHANG Congzhi,ZHANG Longyun,LIYanrong and PU Chun
(Yanghe Distillery Co.Ltd.,Suqian,Jiangsu 223800,China)

In this study,the metabolites of functional bacteria for soft-flavor Baijiu production were investigated.The metabolic flavoring compounds from different bacteria strains were identified.Through the analysis of the ratio of different flavoring compounds,the optimum ratio of different bacteria strains for mixed fermentation was determined.Furthermore,the content of the metabolic flavoring compounds under different fermenting conditions was com pared.The preponderance of metabolic tetramethyl pyrazineetc.in mixed fermentation w as revealed.

soft-flavor Baijiu;functional bacteria;flavoring compounds;tetramethyl pyrazine

TS262.3；TS261.1；TS261.4

A

1001-9286（2017）02-0040-04

10.13746/j.njkj.2016152

2016-05-03；

2016-12-09

张聪芝（1986-），男，山东高唐人，硕士研究生，主要从事酿酒微生物选育、发酵性能及风味化合物研究，E-mail：congw dyx@126.com。

优先数字出版时间：2017-01-04；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20170104.1401.002.htm l。