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不同禽蛋黄中卵磷脂的提取及其水解液成分的鉴定研究

赵思邈1,2任 悦1,2石 晨1邵建群1张 枫1*

(1.首都医科大学药学院实验教学中心，北京 100069；2.首都医科大学药学院2013级临床药学专业本科生，北京 100069)

卵磷脂又名磷脂酰胆碱，是磷脂中的一种，广泛分布于动植物组织中。卵磷脂是构成生物膜的基本物质，生物膜的正常功能表达，以及人体衰老、动脉硬化、心脑血管疾病等都与卵磷脂的变化有关系[1]。卵磷脂也是一种天然表面活性剂，并在医药、食品、化工等领域有着诸多的应用[2]。卵磷脂主要存在于油料作物种子和蛋黄中, 尤其在蛋黄中含量可达10%左右[3]。

在卵磷脂的提取研究上，主要是有机溶剂提取法和超临界CO2萃取法[4-5]。后者方法对设备要求较高，成本也高[6]。而有机溶剂提取法操作简便，易于控制，是目前应用研究较多的蛋黄卵磷脂提取方法[7-8]。根据卵磷脂不溶于丙酮，易溶于乙醇的性质，实验中采用了乙醇为提取溶剂，同时比较研究了超声提取和研磨提取两种方法对提取不同蛋黄中卵磷脂提取率的影响。并对提取到的各种禽蛋卵磷脂进行了完全水解，对水解产物中的脂肪酸、甘油、胆碱和磷酸进行了相应的鉴定实验。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

乙醇、乙醚、丙酮、乙酸铅、硫酸铜、碘化铋钾、钼酸铵、氨基萘酚磺酸、硫酸、硝酸、氢氧化钠等均为分析纯。

电子分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；减压抽滤装置、蒸馏装置等。

1.2 实验方法

1.2.1 卵磷脂的超声提取

取熟蛋黄1个，在电子天平中称质量并记录蛋黄的质量(M1)。将蛋黄置于干净的锥形瓶中并将其捣碎，然后加入95%(体积分数)乙醇20 mL，放入超声仪中超声提取20 min。取出后，用布氏漏斗减压过滤，充分挤压滤干后把蛋黄滤渣再移入锥形瓶中。在蛋黄滤渣中又加入95%(体积分数)乙醇10 mL，并超声提取10 min后减压过滤，滤渣用2 mL无水乙醇洗3遍，抽干后，合并两次滤液到100 mL蒸馏烧瓶中。

安装蒸馏装置，常压蒸馏尽量除去提取液中的乙醇，烧瓶中得到黄色油状物。冷却后，加入5 mL乙醚，搅拌使油状物溶解。然后搅拌下慢慢加入15 mL左右的丙酮，振摇，即有卵磷脂析出。除去其中丙酮，并使残余的丙酮全部挥发掉后，电子天平称质量并记录提取到的卵磷脂质量(M2)。

1.2.2 卵磷脂的研磨提取

研磨提取方法所用提取溶剂乙醇的用量同超声提取，只是在操作方法中把第一次超声20 min，改为在研钵中研磨20 min；第二次超声10 min，改为在研钵中研磨10 min，其他处理步骤同超声提取。

1.2.3 提取率计算

1.2.4 卵磷脂的水解

把提取到的卵磷脂装入锥形瓶中，加入15 mL 20%(质量分数)氢氧化钠溶液，放入沸水浴中加热搅拌15 min，使卵磷脂充分水解。冷却后，在玻璃漏斗中用双层纱布过滤得水解液，水解液供组成鉴定用。过滤后留在纱布上的白色泡沫状物，为水解后的脂肪酸钠，供脂肪酸鉴定用。卵磷脂水解后应生成高级脂肪酸、甘油、胆碱和磷酸，水解反应如下[9]。

1.2.5 卵磷脂的水解液成分鉴定

把提取到的卵磷脂按本文“1.2.4”项方法充分水解以后，生成的水解产物含有高级脂肪酸、甘油、胆碱和磷酸，可按下方法依次进行相应的水解液成分鉴定。

1)脂肪酸的鉴定：取卵磷脂水解过滤时留在纱布上的白色泡沫状物，即高级脂肪酸钠盐放入试管中，加1滴20%(质量分数)氢氧化钠与5 mL蒸馏水，然后逐滴加入硝酸酸化，当溶液出现混浊现象时停止滴加，此为脂肪酸的钠盐变为不溶于水的脂肪酸。然后在试管中逐滴加入10%(质量分数)乙酸铅溶液，有明显的高级脂肪酸铅盐的白色沉淀产生，表明水解后产生了游离的高级脂肪酸。

2)甘油的鉴定：在试管中加入1%(质量分数)硫酸铜溶液1 mL，20%氢氧化钠溶液2滴，有氢氧化铜沉淀生成。再加入1 mL水解液，振摇，沉淀溶解生成绛蓝色的甘油铜溶液[10]，表明水解液中有甘油产生。

3)胆碱的鉴定：在一支试管中加入水解液1 mL，加入硫酸使其酸化, 再逐滴加入约5～6滴碘化铋钾并振摇，渐渐形成浑浊的橘或砖红色，此为胆碱的特性反应[11]，表明水解液中有胆碱存在。

4)磷酸的鉴定：在一支试管中加入0.5 mL水解液，滴加硫酸使其酸化后，再滴加5滴钼酸铵试剂， 1 mL氨基萘酚磺酸溶液，振摇后水浴加热15 min，试管液体为蓝色，此为磷钼蓝的颜色，表明水解液中存在磷酸盐[12]。

2 结果

2.1 不同提取方法对蛋黄卵磷脂提取率的影响

根据卵磷脂溶于乙醇，而不溶于丙酮的特性，分别用乌鸡蛋、鸭蛋和鸡蛋的蛋黄，采用超声提取方法和研磨提取方法，对乌鸡蛋、鸭蛋和鸡蛋的蛋黄进行卵磷脂的提取方法对比研究，卵磷脂提取率的结果见图1。

图1 超声和研磨提取蛋黄卵磷脂的提取率

2.2 不同禽蛋黄中卵磷脂的含量

由于超声方法可以有效地从蛋黄中提取到卵磷脂，表1是不同禽蛋黄采用超声方法提取卵磷脂得到的提取率结果。其中编号3采用的是未煮熟的生鸡蛋黄，其他均采用煮熟的蛋黄。编号4为放置时间为2个月以上的鸡蛋，标记为过期鸡蛋。

表1 不同禽蛋黄超声提取卵磷脂的提取率

2.3 水解液鉴定结果

表2为采用超声方法提取到的各种禽蛋黄的卵磷脂经碱性水解后，按照本文“1.2.5”项所述的鉴定方法，对编号1～6各种蛋黄卵磷脂水解液的鉴定结果。“+”号表示实验现象为正结果，其中“++”表示产生实验现象明显且快速。从鉴定结果可知，从乌鸡蛋、鸡蛋、鸭蛋和鹅蛋的蛋黄中提取到的卵磷脂都符合已知的卵磷脂的结构特征。

表2 卵磷脂水解液的鉴定结果

3 讨论

乙醇作为卵磷脂的提取溶剂，采用超声方法提取卵磷脂的提取率远远高于采用研磨的方法(图1)。这可能是由于超声波产生的强烈震动、高的加速度以及热效应，破坏了细胞壁，使溶剂易渗透到细胞中，从而提高了卵磷脂的提取率。故超声提取方法是一种非常有效的从禽蛋中提取卵磷脂的方法。

卵磷脂因最早从蛋黄中提取出来而得名，在实验所研究的乌鸡、鸡、鸭、鹅蛋的蛋黄中，乌鸡蛋黄的卵磷脂含量最高；其次是鸭蛋、鸡蛋；鹅蛋黄虽然大，但它的卵磷脂的含量不高(表1)。新鲜的鸡蛋比放置过久的鸡蛋卵磷脂的含量高。按照本实验方法，采用煮熟了的鸡蛋比生鸡蛋更能有效地从蛋黄中提取到卵磷脂，这可能是由于生鸡蛋黄本身黏稠，提取溶剂不能有效地浸润到内部，导致提取率低。

卵磷脂又名磷脂酰胆碱，是由磷脂酸与胆碱通过酯键结合生成。卵磷脂、磷脂酸的分子结构如下：

由于磷脂酸本身也包含有多个酯键，卵磷脂结构中的这些酯键，可以水解断开。所以卵磷脂在碱性条件下，水解液中会产生脂肪酸、甘油、胆碱和磷酸这四种物质。通过鉴定水解液中的这4种物质的存在，可以说明提取到了卵磷脂。在本实验研究中，对提取到的禽蛋黄的卵磷脂进行碱性水解，并依次鉴定了这些物质(表2)。卵磷脂的水解产物鉴定实验表明，从乌鸡、鸡、鸭、鹅蛋的蛋黄中均可以提取到卵磷脂。这也说明采用乙醇为溶剂的超声提取方法，可以有效地从一枚禽蛋的蛋黄中提取到卵磷脂。卵磷脂与我们日常生活联系密切，希望本实验的研究方法和结果，能够对生活中所食用的禽蛋有所了解，并能够对从事相关蛋黄卵磷脂的提取研究和实验教学工作提供参考。

致谢：在本论文完成过程中，得到了“首都医科大学国家级基础与专业药学实验教学示范中心”和“首都医科大学医学化学与药学示范性校内创新实践基地”两大平台的支持。

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编辑 慕 萌

中央支持地方专项-药学实验室建设(PXM2015_014226_000142)，首都医科大学2015年度校长基金(2015JYY28)。This study was Supported by the Central Government to Support Local Units for the Development of Pharmaceutical Laboratory(PXM2015_014226_000142)， 2015 Principal Fund of Capital Medical University (2015JYY28).

时间：2017-01-17 23∶49

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20170117.2349.038.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.01.023]

2016-09-14)

*Corresponding author， E-mail：zhangf@ccmu.edu.cn