刘艳红，吕淑霞*，李 颖，李 森，王 澜，马 镝

（1.沈阳农业大学生物科学技术学院，辽宁沈阳 110866；2.中国动物疫病预防控制中心动物安全检测室，北京 102600；3.沈阳农业大学工程学院，辽宁沈阳 110866）

大肠杆菌耐药性及氟苯尼考耐药基因floR的研究

刘艳红1，吕淑霞1*，李 颖2，李 森3，王 澜1，马 镝1

（1.沈阳农业大学生物科学技术学院，辽宁沈阳 110866；2.中国动物疫病预防控制中心动物安全检测室，北京 102600；3.沈阳农业大学工程学院，辽宁沈阳 110866）

本实验对某地养殖场猪源和鸡源大肠杆菌的耐药性及氟苯尼考耐药基因floR进行分析，旨在了解我国大肠杆菌的耐药现状，以降低对养殖业的危害，减少菌株耐药性的传播，为兽医临床用药及兽药管理提供科学依据，为新型抗菌药物的研制奠定理论基础。采用国标法分离鉴定大肠杆菌，肉汤微量稀释法进行药敏实验，PCR法检测氟苯尼考floR基因，膜过滤法进行转化接合实验。结果表明：共分离大肠杆菌293株，分离率为73.3%，其中猪源157株，鸡源136株；大肠杆菌对磺胺类、四环素类和氨基糖苷类药物的耐药性相对严重，对氯霉素类、氟喹诺酮类和β-内酰胺类药物相对敏感；与欧盟EUCAST标准相比，该地区大肠杆菌的MIC分布出现明显右移现象；80%以上的大肠杆菌均为多重耐药菌株，以8重和9重耐药菌株为主；氟苯尼考耐药基因floR携带率为61.2%，floR基因可以在菌株间相互转移。样品采集地区养殖场大肠杆菌污染严重，耐药种类逐渐增多，多重耐药现象严重，质粒介导的耐药基因可以在菌株间相互转移。

大肠杆菌；耐药性；耐药基因；floR基因

大肠杆菌是革兰氏阴性菌的典型代表，分为致病性和非致病性两类，其中非致病性大肠杆菌容易获得致病性大肠杆菌的毒力因子而转变为致病菌，引起动物和人的多种疾病[1]。鸡大肠杆菌病常在雏鸡阶段和成年产蛋鸡中的发病率最高，一年四季均可发生，猪大肠杆菌病包括猪白痢、猪水肿等，可导致猪仔大量死亡，对养殖业造成了较大的威胁和重大的经济损失。大肠杆菌也可使人类发生急性腹泻、胆囊炎和尿路感染等疾病，严重者还会造成溶血性贫血，急性肾功能衰竭，甚至死亡。由于抗生素大规模滥用，使大肠杆菌的耐药种类逐渐增多[2-3]，并出现了严重的多重耐药性[4-5]，导致大部分现有药物无效[6]。由质粒介导的耐药基因可以传递给其他动物和人类[7]，不但给养殖业造成了严重的经济损失，同时也带来了食品安全和人类健康问题。近年来，大肠杆菌对氟苯尼考的耐药性日益严重，其耐药机制的研究主要集中在floR基因上[8]，已成为国内外的研究热点。如果细菌对抗生素产生了严重的耐药性，在人类面临细菌引起的流行性传染病时，就会出现找不到药物治疗的危机[9]。因此，了解大肠杆菌的耐药现状，明确其耐药机制，不但为兽医临床用药和兽药管理提供科学依据，也可以为新药的研制奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 某养殖场猪肛门拭子200份，鸡肛门拭子200份。

质控大肠杆菌ATCC 25922，沙门标准菌株CVCC 541 中国动物疫病预防控制中心提供。

麦康凯琼脂，LB营养琼脂，琼脂糖，2×Taq PCR Master Mix，细菌基因组DNA提取试剂盒 北京天根生化科技有限公司；API 20E试剂条 北京威泰科生物技术有限公司；冻干型细菌定量药敏MIC测试盒 天津市金章科技有限公司。

1.2 仪器与设备 生物安全柜来自北京联合科仪科技有限公司；自动高压灭菌器来自北京百莱普惠科技有限公司；生化培养箱来自上海一恒科技有限公司；PCR仪，凝胶成像仪，电泳仪来自北京元业伯乐科技发展有限公司；台式离心机（Sigma1-14）北京博励行仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品采集 2015年从某养殖场采集猪肛门拭子200份，鸡肛门拭子200份，储存于无菌运送培养基中，48 h内分离大肠杆菌。

1.3.2 大肠杆菌分离鉴定 将运送培养基中的拭子接种于麦康凯琼脂平板，37℃培养24 h，取粉红色单菌落接种于麦康凯琼脂平板纯化一代，37℃培养48 h；再挑取粉红色单菌落接种于LB营养琼脂平板，37℃过夜培养。取营养琼脂平板上的单菌落用API 20E试剂条进行生化鉴定，具体操作参照说明书。

1.3.3 药敏实验 鉴定完的大肠杆菌用冻干型细菌定量药敏测试盒对以下6大类抗生素12种药物进行药敏检测：β-内酰胺类：氨苄西林（AM）、阿莫西林/克拉维酸（A/C）、头孢噻呋（CF）；磺胺类：磺胺异恶唑（SZ）、复方新诺明（SXT）；四环素类：四环素（TE）、多西环素（DO）；氨基糖苷类：庆大霉素（GM）、大观霉素（SPT）；氯霉素类：氟苯尼考（FFC）；氟喹诺酮类：恩诺沙星（ENR）、氧氟沙星（OFX）。用大肠杆菌ATCC 25922做质控对照，具体操作参照药敏测试盒说明书进行。

1.3.4 氟苯尼考耐药基因floR检测 位于转座子上的氯霉素抗性基因floR可导致革兰氏阴性菌对氯霉素产生耐药[10]，主要对氟苯尼考产生耐药性，其耐药机制也是近年来的研究热点。本文对药敏实验中氟苯尼考耐药的大肠杆菌进行floR耐药基因检测。用细菌基因组DNA提取试剂盒提取大肠杆菌基因组DNA。

从 GenBank中找到floR基因序列，用Primer 5.0设计引物并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，如表1所示。

表1 引物序列

PCR反应体系：上下游引物各1 μ L，DNA模板5 μ L，2×Taq Master Mix 12.5 μ L，用ddH2O补齐至25 μ L。

PCR反应程序：第1步，94℃预变性5 min；第2步，设置30个循环，每个循环94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s；第3步，72℃延伸2 min，4℃保存。同时用水做阴性对照。

取5 μ L PCR产物进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳，电压90 V，电泳时间30 min，置于凝胶成像仪观察结果。

1.3.5 floR基因转化接合实验 floR基因存在于大肠杆菌质粒上，可在菌株间相互传播，本文采用对氟苯尼考有较高耐药表型且携带floR基因的大肠杆菌作为供体菌株，用对氟苯尼考不耐药的沙门氏菌CVCC 541作为受体菌株。

接合实验采用膜过滤接合法进行，供体菌和受体菌活化后均在LB培养液中，37℃摇菌4 h，使菌体长到对数期；供体菌与受体菌液以1：5混合，混合物用0.45 μm的滤膜过滤，将滤膜置于LB营养琼脂平板上，37℃过夜培养；然后用LB液体培养基冲洗滤膜上的细菌混合物至含有8 μg/mL氟苯尼考药物的沙门氏菌显色培养基上37℃过夜培养；挑取紫色的沙门氏菌做药敏实验和floR基因的PCR扩增，看受体菌是否获得供体菌的耐药表型和相应抗性基因，从而判断抗性基因是否发生转移。

2 结果与分析

2.1 大肠杆菌分离率 400份样品共分离到大肠杆菌293株，分离率为73.3%，其中猪源157株，鸡源136株，说明此地区养殖场大肠杆菌污染严重。

2.2 药敏实验结果

2.2.1 大肠杆菌耐药表型 293株大肠杆菌对12种抗菌药物都有不同程度的耐药见表2。由表2可以看出，大肠杆菌对SZ耐药率最高，占93.5%；其次为TE、SXT、DO、AM、SPT、 GM和FFC，耐药率分别为86.4%、82.6%、82.3%、79.5%、73.0%、65.5%和50.2%；对A/C、ENR和OFX相对敏感，耐药率分别为45.4%、38.6%和30.7%；对CF最为敏感，耐药率仅占18.4%。总体耐药现象严重，对磺胺类、四环素类和氨基糖苷类药物相对严重，对氯霉素类、氟喹诺酮类和β-内酰胺类药物相对敏感。293株大肠杆菌中，猪源和鸡源的耐药性也有所差异，由表3可以看出，猪源和鸡源大肠杆菌对AM、SZ、TE、DO和 GM的耐药程度趋势相同，对SPT和FFC的耐药性，猪源明显高于鸡源，而对A/C、CF、SXT、ENR和OFX的耐药性，鸡源却明显高于猪源。说明对于不同种类的动物，对某些抗生素的耐药性不同，应该区分用药，减少耐药菌株的产生。

表2 大肠杆菌耐药性

表3 猪源和鸡源大肠杆菌耐药性

图3 氟苯尼考的MIC分布

2.2.2 MIC分布 选取在我国比较常用且耐药性比较强的四环素类药物TE（四环素）、氨基糖苷类药物SPT（大观霉素）和氯霉素类药物FFC（氟苯尼考），对本文所分离的大肠杆菌的MIC分布与欧盟2015年公布的EUCAST标准进行比较，结果如图1、2、3所示。从图中可以看出，样品采集地区养殖场分离出的大肠杆菌对TE、SPT和FFC药物的耐药菌株大部分分布在高浓度区域，与欧盟EUCAST标准比较，这3种药物的MIC分布均出现明显右移的情况，说明该地区对这3种药物的耐药性严重超过了欧洲国家，细菌耐药现象非常严重，应及时采取措施控制。

2.2.3 多重耐药性 从上述药敏实验结果可以看出，大肠杆菌的耐药现象非常严重，其多重耐药性结果如图4所示。由图4可以看出，80%以上的大肠杆菌为多重耐药菌株，主要以8重和9重耐药菌株为主，最多可以耐12种抗菌药物，占4.1%。

图4 大肠杆菌多重耐药性

2.3 氟苯尼考耐药基因floR的携带率 293株大肠杆菌中有147株对氟苯尼考耐药，其中有90株含有floR基因，占61.2%，说明floR基因是导致氟苯尼考耐药的重要机制，其具体作用机制还需进一步研究。部分菌株floR基因的电泳图如图5所示。

图5 floR基因的PCR电泳图，673bp

2.4 转化接合结果 用携带floR基因，并对氟苯尼考有较高耐药表型的大肠杆菌作为供体菌，用对氟苯尼考不耐药的沙门氏菌CVCC 541作为受体菌株。通过转化接合，受体沙门氏菌获得了供体大肠杆菌的floR基因，并对氟苯尼考表现为耐药，说明质粒介导的耐药基因可以在不同菌株间相互转移。转化前后的floR基因的PCR结果如图6所示。

图6 floR基因的转化接合结果（673bp）

3 讨 论

3.1 大肠杆菌分离率 本实验可以看出该地区养殖场的大肠杆菌分离率较高，污染严重，这不仅给养殖业带来巨大的经济损失，严重阻碍着养殖业的发展，而且给人类健康造成了威胁，存在严重的食品安全隐患。

3.2 大肠杆菌耐药性 本文所分析的大肠杆菌对磺胺类和四环素类耐药严重，这是由于该地区多年来长期使用所导致，而对头孢噻呋敏感性较好，头孢噻呋为第3代头孢菌素类抗生素，使用时间短，没有在全国范围内广泛使用，所以还没有产生很强的耐药性，今后在使用头孢噻呋时，应注意适时适量，防止菌株很快对其产生耐药性。大肠杆菌耐药性结果对当地养殖场的预防用药和治疗用药具有实际指导与借鉴意义，在该地区应该停止使用SZ、TE、SXT和DO这4种抗菌药物，对SPT、 GM和FFC应该改变药物剂量或者与其他同类药物交叉使用，A/C、ENR和OFX还可以继续在该地区使用，但要避免滥用情况，对症用药，否则很快就会出现耐药菌株而使该药物失效。

3.3 氟苯尼考耐药基因 floR的携带及转移情况对氟苯尼考耐药的大肠杆菌，有61.2%含有floR基因，说明大肠杆菌对氟苯尼考产生耐药性主要是由于获得了floR耐药基因导致，而floR基因还可以在菌株间相互转移，在一定程度上对耐药菌产生的分子机制和新药的研制提供理论基础。

4 结 论

研究结果可以看出,样品采集地区大肠杆菌污染严重，耐药种类逐渐增多，多重耐药现象严重，对磺胺类和四环素类耐药最为严重，对氟喹诺酮类和β-内酰胺类较为敏感。四环素、大观霉素和氟苯尼考3种药物的MIC分布与欧盟相比有明显右移现象。floR基因是导致大肠杆菌对氟苯尼考耐药的重要机制，质粒介导的耐药基因可以在菌株间相互转移。

[1] 何敏, 易本驰, 陈敏. 猪大肠杆菌对抗生素耐药性的研究进展[J]. 黑龙江畜牧兽医, 2011, (3): 27-30.

[2] 汀婷婷. 不同时期猪源大肠杆菌对抗生素耐药表型.耐药基因比较研究[D] .雅安:四川农业大学, 2008: 37-38.

[3] 于阿芳. 鸡致病性大肠杆菌的药敏实验,血清型鉴定及耐药基因的PCR检测[D] . 泰安:山东农业大学, 2009: 46-47.

[4] 汤景元, 王红宁, 张鹏举. 95个猪场大肠杆菌耐药表型及氨基糖苷类药物耐药基因型调查[J].畜牧兽医学报, 2008, 39(4): 472-477.

[5] 张飞燕. 鸡源性大肠杆菌耐药性检测及相关耐药基因的研究[D]. 保定:河北农业大学, 2013:27-29.

[6] 邢艳苹, 王瑜. 动物源性大肠杆菌耐药性分析[J].吉林畜牧兽医, 2010, 31(11): 7-10.

[7] 蒋培余, 潘劲草. 细菌遗传元件水平转移与抗生素抗性研究进展[J]. 微生物学通报, 2006, 33(4): 167-171.

[8] 郑朝朝, 刘聚祥, 李辉,等. 鸡源,猪源大肠杆菌氟苯尼考耐药基因foR的克隆与序列分析[J].华北农学报, 2010, 25(5): 72-75.

[9] 吴聪明. 细菌耐药性扩散的机制[J].动物医学进展, 2003, 24(4): 6-11.

S828.5

A

10.19556/j.0258-7033.2017-01-001

2016-07-25；

2016-08-24

刘艳红（1992-），女，山西人，硕士，主要从事微生物分子生物学的研究，E-mail:1187741673@qq.com

*通讯作者：吕淑霞，E-mail:lushuxia@hotmail.com.