岳 锋 ， 杨 健 ， 周娟娟 ， 朱艳平 ， 李 鹏 ， 孙国鹏 ， 张艳芳 ， 王选年

(新乡学院生命科学技术学院 生物技术研究中心 ， 河南 新乡 453003)

程序性死亡因子-1(Programmed Death-1，PD-1)属于CD28超家族成员，是50 kDa～55 kDa左右的Ⅰ型跨膜蛋白分子，诱导表达于活化的T 细胞、B 细胞、自然杀伤细胞、单核细胞和树突状细胞[1]。PD-1有PD-L1和PD-L2两个配体。PD-L1广泛表达于T细胞、B细胞、树突状细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞以及多种肿瘤细胞[2]。PD-L2则诱导性表达于树突状细胞、巨噬细胞、髓源性肥大细胞和生发中心B细胞[3]。PD-1/PD-L是重要的免疫负调节通路，PD-1所介导的负协同刺激信号能导致T细胞和B细胞的凋亡和功能耗竭[4]。PD-1/PD-L抑制途径在自身免疫性疾病的发生发展以及慢性病毒感染中均发挥了重要作用[5-6]。采用抗体阻断PD-1/PD-L通路可有效提高抗慢性病毒感染或肿瘤性疾病的免疫力[7-8]。因此,制备抗猪PD-1单克隆抗体具有重要的理论研究和实际应用价值。

1 材料与方法

1.1 试验材料 重组猪PD-1胞外区蛋白由本实验室纯化保存，鼠NS0骨髓瘤细胞由本实验室冻存；BALB/c小鼠，购自上海斯莱克实验动物有限公司。

1.2 抗猪PD-1单抗的制备

1.2.1 免疫和细胞融合 重组猪PD-1胞外区蛋白与弗氏佐剂乳化即为免疫原。颈背部皮下注射免疫雌性BALB/c小鼠，50 μg/只，首免用弗氏完全佐剂，次免用弗氏不完全佐剂，每次间隔14 d，融合前3 d，加强免疫。融合前1 d制备饲养细胞。用杂交瘤细胞融合技术融合免疫BALB/c小鼠的脾细胞和NS0细胞，融合好放置37 ℃ 5% CO2培养箱中培养。

1.2.2 阳性杂交瘤细胞的筛选和克隆 融合细胞培养10 d吸取少量上清用于筛选；14 d阳性孔半量更换HT培养基，同时对阳性孔细胞转至24孔培养板扩大培养，准备克隆化，间接ELISA法筛选杂交瘤培养上清液，对筛选的特异性较强的阳性孔转至24孔培养板中扩大培养克隆化。直至所有克隆孔阳性率为100%时，定杂交瘤细胞株。

1.2.3 腹水的制备和纯化 将8周龄雌性BALB/c小鼠腹腔注射0.5 mL液体石蜡致敏。7 d后腹腔注射5×106的杂交瘤细胞，待小鼠腹部明显膨大，抽取腹水。IgG类单克隆抗体纯化试剂盒纯化单抗。

1.3 抗猪PD-1 单抗特异性鉴定 间接ELISA和 Western-Blot检测单克隆抗体的特异性，酶标仪读取ELISAOD450值，Western-Blot结果显色后拍照记录。

1.4 单抗生物学特性鉴定

1.4.1 单克隆抗体效价的检测 杂交瘤细胞上清以2倍倍比梯度稀释，重组PD-1胞外区蛋白包板，间接ELISA法检测杂交瘤上清和腹水效价，未免疫鼠血清为阴性对照，各孔OD450值以P/N>2.1为阳性。

1.4.2 单克隆抗体亚型鉴定 用Ig亚类鉴定试剂盒鉴定上述单克隆抗体的Ig亚类，操作步骤严格按说明书进行。

1.4.3 杂交瘤细胞株分泌单抗的稳定性鉴定 分别收集体外连续传代的杂交瘤细胞株上清，用间接ELISA法测定其效价，并冻存细胞，1个月后复苏冻存的细胞，检测其培养上清液中的抗体效价，检测3次，每次间隔1个月，评价杂交瘤细胞分泌抗体的稳定性。

1.4.4 单抗与猪外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)上PD-1蛋白的结合 前腔静脉采集猪抗凝血5 mL，密度梯度离心法分离PBMC细胞， 取106个PBMC加入终浓度10 μg/mL抗PD-1的单克隆抗体，鼠IgG1为同型抗体对照，37 ℃作用1 h，用PBS洗涤3次，加入FITC标记的羊抗鼠IgG(1∶500倍稀释)，37 ℃避光作用 1 h，用PBS洗涤3次，PBS悬浮细胞，流式细胞术检测。

2 结果

2.1 免疫小鼠血清效价 首免后3只小鼠的血清抗体效价分别为3.2×103、3.2×103和6.4×103；三免后分别为2.56×104、2.56×104和5.12×104。

2.2 单抗特异性鉴定

2.2.1 间接ELISA 鉴定 经3次亚克隆，获得1 株分泌特异性单抗的杂交瘤细胞，杂交瘤细胞株命名为2B5，分泌单抗为swPD1-2B5。该单抗能与重组猪PD-1胞外区蛋白反应，不与鸡PD-1、Rosetta上清和pET-32a空载体蛋白反应，说明单抗具有良好的特异性。

2.2.2 Western-Blot 鉴定 Western-Blot 检测结果见图1，单抗swPD1-2B5与猪PD-1胞外区蛋白(分子量为33 kDa)发生特异性反应条带，但不与对照组Rosetta上清与pET-32a(+)空载体蛋白反应。

图1 Western-Blot鉴定结果

M: 蛋白Marker； 1： 猪PD-1胞外区蛋白； 2： Rosetta上清，3： pET-32a(+)空载体蛋白

2.3 单抗生物学特性鉴定

2.3.1 单克隆抗体效价的检测 杂交瘤细胞上清的效价为1∶212(2B5)；腹水的效价为1∶2.048×105(2B5)。

2.3.2 单抗Ig亚类及稳定性鉴定 单抗swPD1-2B5亚型为IgG1。连续3个月复苏杂交瘤细胞，间接ELISA检测上清效价均达到1∶1×212以上。

2.3.3 单抗与猪PBMC上PD-1蛋白的结合情况 猪PBMC细胞膜上表达PD-1蛋白，用猪PBMC细胞为试验材料，检测单抗与PD-1天然蛋白的结合，流式细胞术结果显示，单抗的荧光强度比同型抗体对照的荧光强度明显增强(见图2)，表明单抗swPD1-2B5可以与猪PBMC上的PD-1蛋白结合。

图2 单抗与猪PBMC上PD-1 的结合

3 讨论

PD-1/PD-L信号通路对获得性免疫应答起负调控作用，该种调控对机体自身而言是为了避免过度免疫应答对机体组织的损伤，是一种自我保护机制，但在病毒慢性持续性感染过程中，PD-1/PD-L通路活化导致机体免疫功能损伤[3-4]。本实验室前期研究表明，猪瘟病毒和猪圆环病毒2型感染，可以引起猪PD-1/PD-L通路活化，是导致机体免疫功能损伤的致病机制之一[9-10]，抗PD-1或PD-L1抗体阻断PD-1/PD-L通路可以恢复机体的免疫功能，在相关性疾病治疗中具有重要意义[4-7]。因此，制备抗猪PD-1单抗对检测PD-1/PD-L通路活化和阻断PD-1/PD-L具有重要的理论和应用价值。

本试验运用常规的ELISA抗体筛选方法，以诱导表达纯化的猪PD-1胞外区蛋白为免疫原，免疫BALB/c小鼠产生针对靶分子的特异性免疫应答。运用ELISA方法对杂交瘤细胞进行筛选，筛选出阳性上清液的生长孔内常会出现两个以上的杂交瘤细胞克隆，有的克隆细胞分泌的不是目标抗体，有的可能不分泌抗体，因此，要利用克隆培养方法将阳性杂交瘤细胞筛选出来。最常用的杂交瘤克隆培养法是有限稀释法和软琼脂培养法。检测该单抗与猪天然PD-1蛋白结合与否对其应用价值至关重要，由于PD-1蛋白主要表达在活化的T细胞、B细胞、NK细胞、NKT 细胞、单核细胞和树突状细胞[1]，因此可以用猪PBMC细胞来检测该单抗与猪天然PD-1蛋白的结合，流式细胞术结果表明，筛选单抗可以与猪PBMC上的PD-1蛋白有效结合。因此本研究获得的单抗swPD1-2B5对研究猪体内某些组织细胞上PD-1的表达水平变化与疾病的进程关系具有重要理论意义和应用价值。

[1] Golden-Mason L, Palmer B, Klarquist J,etal. Up regulation of PD-1 expression on circulating and intrahepatic hepatitis C virus-specific CD8 + T cells associated with reversible immune dysfunction[J]. Journal of virology, 2007, 81(17): 9 249-9 258.

[2] Chen B J, Chapuy B, Ouyang J,etal. PD-L1 expression is characteristic of a subset of aggressive B-cell lymphomas and virus-associated malignancies[J]. Clinical cancer research, 2013, 19(13): 3 462-3 473.

[3] Keir M E. Butte M J, Freeman G J,etal. PD-1 and its ligands in tolerance and immunity[J]. Annual review of immunology, 2008, 26: 677-704.

[4] Goodman A, Patel S P, Kerzrock R. PD-1-PD-L1 immune-checkpoint blockade in B-cell lymphomas[J]. Nature reviews clinical oncology, 2016, 168, Epub ahead of print.

[5] Carter L L, Leach M W, Azoitei M L,etal. PD-1/ PD-L1, but not PD-1/ PD-L2, interactions regulate the severity of experimental autoimmune encephalomyelitis[J]. Neuroimmunology, 2007, 182: 124-134.

[6] Velu V, Shetty R D, Larsson M,etal. Role of PD-1 co-inhibitory pathway in HIV infection and potential therapeutic options[J]. Retrovirolgy, 2015,12: 14.

[7] Akiyama Y, Nonomura C, Kondou R,etal. Immunological effects of the anti-programmed death-1 antibody on human peripheral blood mononuclear cells[J]. International journal of oncology, 2016, 49(3): 1 099-1 107.

[8] Jazirehi A R, Lim A and Dinh T. PD-1 inhibition and treatment of advanced melanoma-role of pembrolizumab[J]. American journal of cancer resrearch, 2016, 6(10): 2 117-2 128.

[9] Yue F, Zhu Y P, Zhang Y F,etal. Up-regulated expression of PD-1 and its ligands during acute Classical Swine Fever virus infection in swine[J]. Research in veterinary science, 2014, 97(2): 251-256.

[10] Yue F, Cheng A C, Zhu Y P,etal. Overexpression of programmed death ligands in naturally occurring postweaning multisystemic wasting syndrome[J]. Viral Immunol, 2015, 28(2): 101-106.