温晓敏，张娜，月丫，田淑芬*

（1. 天津市设施农业研究所/天津市葡萄遗传与育种企业重点实验室，天津 300192；2. 天津师范大学生命科学学院，天津 300387）

葡萄多倍体育种成果及影响因素概述

温晓敏1,2，张娜1，月丫1,2，田淑芬1*

（1. 天津市设施农业研究所/天津市葡萄遗传与育种企业重点实验室，天津 300192；2. 天津师范大学生命科学学院，天津 300387）

我国近20年通过审定且确定倍性的葡萄新品种中，共有5个通过杂交方法培育出的三倍体葡萄新品种，14个杂交育成的四倍体葡萄新品种，4个通过芽变选育得到的四倍体葡萄新品种，4个实生选育出的四倍体葡萄新品种，4个秋水仙素诱变而来的四倍体葡萄新品种。三倍体杂交育种和四倍体诱变育种效率较低，概述了近年来对三倍体胚挽救杂交育种和四倍体秋水仙素诱变育种影响因素的研究。综述了育成种质的鉴定评价方法和意义，对今后有望培育兼具大粒、无核、香味等优良性状的多倍体葡萄新品种进行了展望。

多倍体；葡萄；新品种；育种方法；影响因素；种质评价

葡萄是无性繁殖的多年生树种，能将多倍体的优良性状稳定地遗传下去，进而克服了多倍体育性差无法大量用于生产的缺点[1]。同时多倍体葡萄具有茎粗、节间短、果粒巨大、同化物质含量高、种子少等优点，特别是三倍体葡萄，因其大多数高度不育，所以果实无核或少核[2]。以上优点使得葡萄多倍体育种研究更具意义[3]。目前育成的多倍体葡萄主要是三倍体和四倍体。本文分别对三倍体、四倍体的育种方法，近年来育种成果、影响因素及育成种质的评价做了综述。旨在为了解近期多倍体育种情况及多倍体育种工作提供参考。

1 葡萄多倍体育种

三倍体葡萄由于果实无核或少核，使得三倍体育种成为无核品种选育的主要途径之一。四倍体葡萄具有果粒大、营养物质含量高的优点，四倍体育种是培育大粒葡萄的育种方法。三倍体与四倍体育种符合当前大粒、无核的主要葡萄育种目标。杂交育种是葡萄多倍体育种的常规方法[4]。育成的优良品种约有68%为杂交方法育成的[5]。

1.1 三倍体葡萄育种

目前无核三倍体育种的主要途径包括：二倍体与四倍体间正反交、胚乳培养、花药培养、对自然突变的选择等[3]。花药培养和胚乳培养获得多倍体成功率低，实用性差。最常用的三倍体育种方法即杂交育种。

蒋爱丽等[6-7]用二倍体“希姆劳特”分别与四倍体“藤稔”和“巨峰”杂交选育出了三倍体无核葡萄品种“沪培3号”和“沪培1号”。赵胜建等[8-10]用二倍体“郑州早红”和四倍体“巨峰”杂交育成了三倍体葡萄新品种“无核早红”和“红标无核”，用“玫瑰香”和“巨峰”杂交育成三倍体品种“月光无核”。

1.2 四倍体葡萄育种

四倍体育种的主要方法包括有性杂交、人工诱变、对自然变异的选择等[1]。

1.2.1四倍体杂交育种

四倍体葡萄杂交是获得四倍体新品种的最主要途径，己选育出许多四倍体新品种。如近年来我国审定的杂交四倍体葡萄新品种有“玫香宝”（阿登纳玫瑰×巨峰）[11]、“光辉”（香悦×京亚）[12]、“申华”（京亚×优系86-179）[13]、“申玉”（藤稔×红后）[14]、“申丰”（京亚×紫珍香）[15]、“蜜红”（沈阳玫瑰×黑奥林）[16]、“巨玫瑰”（沈阳大粒玫瑰香×巨峰）[17]、“黑玫香”（沈阳大粒玫瑰香×巨峰）[18]、“春光”（巨峰×早黑宝）、“蜜光”（巨峰×早黑宝）、“峰光”（巨峰×玫瑰香）、“宝光”（巨峰×早黑宝）[19]、“玉波一号”（紫地球×达米娜）、“玉波二号”（紫地球×达米娜）[20]。

1.2.2通过对自然芽变的筛选获得葡萄四倍体新品种

二倍体葡萄自然突变产生多倍体的途径分为三类[21]：合子或体细胞加倍、配子加倍和体细胞融合。此外，多倍体也可产生新的变异[22]。芽变属于体细胞的变异，芽变产生三倍体的发现较少，更多的是发现二倍体芽变成的四倍体和四倍体变异产生新的四倍体。选择四倍体的优良芽变是改良葡萄品种的重要途径之一。2010年以来审定的芽变品种，已鉴定其为四倍体的有：“红地球”的芽变“红太阳”[23]、“礼泉超红”[24]，“巨峰”的芽变“峰早”[25]、“宇选1号”[26]。异常的环境更易诱导突变，自然突变是自然发生的，不受人为控制。通过自然芽变筛选培育葡萄多倍体新品种，速度缓慢，随机性大[27]。

1.2.3通过实生选育获得葡萄四倍体新品种

依据葡萄实生选育种间变异较大的原理[28]通过对葡萄实生播种，从中选育出性状优良的葡萄品种。近年来从“巨峰”实生系中选育出了四倍体葡萄新品种“申宝”[29]、“贵园”[30]、“峰后”[31]；用“甲裴露”实生播种选育出了四倍体葡萄新品种“红十月”[28]。通过播种进行有性繁殖，利用葡萄种子间可能的变异，可增加多倍体新品种产生可能性。

1.2.4人工诱变培育葡萄四倍体新品种

多倍体不仅可以自然发生，也可以通过人工诱变，人工诱导植物多倍体的方法分为物理法和化学法。

物理方法主要有切伤、摘心、嫁接、改变温度。反复切伤和摘心会产生多倍体的原因在于反复切伤、摘心刺激细胞分裂，细胞核分裂速度较细胞分裂速度快，于是在细胞内形成双核或多核，从而诱导产生多倍体；同理嫁接时在愈合处也易形成染色体加倍枝条；改变温度形成多倍体的原因在于当温度过高或过低会阻碍细胞正常分裂[27]。除此之外还包括X射线、离心力等物理诱变方法，但效率较低。物理法诱变的葡萄新品种较少，近几年育成的葡萄新品种，如：“瑞都红玉”葡萄为“瑞都香玉”(京秀×香妃)高接时发生的红色芽变[32]。

化学方法主要用秋水仙素处理植物分裂旺盛部位，是人工诱导植物多倍体的最有效方法[33]。秋水仙素可以抑制有丝分裂前期纺锤体的形成，无法牵引染色体均分到细胞两极而使染色体加倍。石雪晖等[34]以萌发的刺葡萄种子为试材，用秋水仙素化学诱导选育出了刺葡萄四倍体新品种“湘酿1号”。常将杂交育种与诱变育种相结合，进行葡萄新品种选育，如“瑰宝”与“秋红”杂交后经秋水仙素诱变选育出四倍体新品种“晚红宝”[25]、“秋黑宝”[35]；以“瑰宝”与“早玫瑰”的杂交种子用秋水仙素诱变育成的四倍体葡萄新品种“早黑宝”[36]。还可用异生长素等对植物进行诱变，但效率极低，成功率一般小于5%[27]。

2 葡萄多倍体育种影响因素

目前我国育成多倍体葡萄品种多为四倍体，三倍体育种效率不高。有必要对其育种方法及影响因素进行总结，为多倍体育种效率的提高提供参考。

2.1 三倍体杂交育种影响因素

杂交培育三倍体，由于不同倍性间杂交障碍，胚败育严重，因此需要通过胚挽救技术在胚败育之前进行离体胚挽救，从而提高杂交后代获得率。胚挽救杂交育种的一般流程为：花粉采集→去雄授粉→取样消毒并剥取胚珠→胚珠培养（胚发育）→剥胚→胚萌发培养→胚成苗培养→继代培养→炼苗移栽[37-38]。

为提高胚挽救成功率，需对胚挽救各阶段影响因素进行优化。杂交组合的选择，取样时间，培养基种类，光、温等培养条件，胚萌发培养时间，胚珠处理方式等对胚挽救效果影响重大。徐海英[39]证明了胚挽救是克服胚败育的有效途径。普遍认为不同杂交组合最佳取样期不同，且与母本成熟期密切相关[39-41]。关于胚发育培养，唐冬梅[41]认为固液双相Nitsch＋GA30.5 mg/L＋IAA 1.5 mg/L和MM3培养基最适宜于无核葡萄离体幼胚的发育，低温会降低胚发育率；暗培养有利于幼胚的发育。而郭印山等[42]认为二倍体与四倍体杂交胚在无机盐浓度较低的White培养基上更有利于胚发育。王素月[40]研究表明在1/2MS＋IAA 0.1 mg/L培养基上有利于胚萌发；剥取裸胚萌发快，且成苗率高。

2.2 四倍体秋水仙素诱变育种影响因素

用秋水仙素诱导葡萄多倍体时，影响诱变率的因素有处理材料的生长状态、秋水仙素浓度和处理时间[4]。罗耀武等[43]用0.2%秋水仙素溶液处理“玫瑰香”葡萄植株的生长点45 h，获得了四倍体“玫瑰香”。张丙秀等[44]探索了秋水仙素浓度及不同处理方法对“京秀”葡萄变异的影响，研究表明对于浸泡单芽茎段法，浓度的影响强于处理时间，最佳诱导浓度及时间为 0.3%处理 24 h；而对于混培法，处理时间的影响却强于浓度，最佳诱导浓度及时间为2000 mg/L处理 30 d。在离体诱变研究，张淑爱等[45]在0.1%秋水仙素溶液中浸泡葡萄试管苗茎段6 h，再扦插在不含秋水仙素的B5培养基中，获得根尖加倍的四倍体“里扎马特”和长粒“无核白”。卢炳芝等[46]用“胜利”葡萄品种带花药的花丝诱导胚状体,然后用0.2%秋水仙素浸泡胚状体5 d，获得同质变异的四倍体。这些方法需经组织培养，对于有核的葡萄品种，以种子为材料诱导加倍，可直接得到加倍植株。

陈俊[47]采用种子浸渍法处理“瑰宝”葡萄天然授粉种子，待催芽4 d后胚茎伸长1 cm左右时，分别用0.2%和0.4%的秋水仙素溶液处理,均获得了同质四倍体。闫爱玲等[48]研究表明当未名玫瑰种子胚根长1.0 cm时，用0.5%秋水仙素处理96 h，其成活率和四倍体率较高分别为11.33%和5.12%。

3 育成葡萄种质鉴定评价

育种后首先应进行早期倍性鉴定，以提高育种效率。定植田间后应调查性状，以便筛选优良种质进一步扩繁、纯化、审定、推广，以及进一步用于新品种的培育。

3.1 倍性鉴定

倍性鉴定最准确常用的方法为染色体计数法和流式细胞仪倍性分析法，其他如：减数分裂观察法、形态学鉴定法、解剖学鉴定法、生理生化指标鉴定法、同工酶电泳谱带的特征法等可作为辅助鉴定方法。

3.1.1染色体计数法

倍性鉴定最直接的方法就是染色体计数法。染色体计数法以根尖、幼芽、幼叶、茎尖、卷须为材料[49]，根据材料不同各步骤略有不同。王小利[50]发现以葡萄根尖为试材，压片成功率最高。钱春[51]在白香蕉葡萄芽变突变体鉴定中，首先采用根尖做试验材料进行初步鉴定，然后对卷须进行连续鉴定，避免了只是根部加倍而地上部不加倍的现象。

染色体计数法包括常规压片法和去壁低渗法[52]。常规压片法需掌握好酸解时间，去壁低渗法需控制好低渗处理和酶解时间。对于储藏物质多的幼芽、幼叶、茎尖、卷须宜采用去壁低渗法，对于根尖采用常规压片法较简便[53]。郭印山[37]用常规压片法对根尖进行了染色体倍性鉴定。常金华[54]运用去壁低渗法对人工诱变的四倍体“玫瑰香”葡萄卷须的染色体进行计数，来确定倍性。孙马[55]用去壁低渗染色体计数法对部分中国野生葡萄的幼叶和幼芽进行了倍性鉴定。

3.1.2流式细胞仪倍性分析

对于染色体数目较多的材料，染色体计数法鉴定较困难。可利用流式细胞光度术（FCM）测定细胞核DNA含量鉴定材料倍性[56-60]。流式细胞仪的问世为植物染色体倍性的研究提供了一条便捷的途径，其鉴定快速方便，且准确性较高[60]。郭印山[37]、张丙秀[44]、赵艳华[60]等利用流式细胞仪分别对葡萄进行了倍性鉴定。

3.2 性状调查

3.2.1物候期调查

调查物候期为评价葡萄经济性状提供了依据，为葡萄新品种的引种栽培管理提供参考。一般调查葡萄萌芽始期、开花始期、开花盛期、浆果开始生长期、浆果始熟期、浆果完熟期、新梢开始成熟期等。三倍体葡萄“无核早红”[8]、“红标无核”[9]为极早熟品种，四倍体“红十月”[28]为极晚熟品种。其他：“玫香宝”[11]、“光辉”[12]、“申华”[13]、“贵园”[30]、“宇选1号”[26]、“峰早”[25]、“早黑宝”[36]为早熟品种；“沪培1号”[7]、“黑玫香”[18]、“申丰”[15]、“巨玫瑰”[17]、“蜜光”[19]为中早熟品种；“沪培3号”[6]、“峰光”、“宝光”[19]、“申宝”[29]、“秋黑宝”[35]为中熟品种；“玉波一号”、“玉波二号”[20]、“申玉”[14]、“峰后”[31]为中晚熟品种；“礼泉超红”[24]、“蜜红”[16]、“红太阳”[23]、“晚红宝”[25]为晚熟葡萄品种。许多多倍体表现出成熟期提前的特点，不同成熟期的葡萄品种极大的延长了葡萄的市场供应，同一成熟期葡萄品种的丰富可满足消费者多样化的需求。

3.2.2植物学特性调查

调查嫩梢、新梢、幼叶、成龄叶、成熟枝条的各项植物学特征，为种质的区别、鉴定提供依据。多倍体葡萄品种较二倍体葡萄多表现为茎粗、节间短、叶片大且厚，叶色浓绿，雌蕊柱头高等特点[1]。

3.2.3生长结果习性

调查植株生长势、萌芽率、副芽萌发力、隐芽萌发力、每结果枝果穗数、结果枝百分率、产量、坐果率等，对种质生产力做评价。经比较多倍体葡萄普遍较二倍体葡萄生长势强、产量高，四倍体葡萄每穗花和果粒数较二倍体少。

3.2.4果实经济性状

调查果穗的形状、有无歧肩、有无副穗、大小、重量、紧密度，果粒的形状、重量、大小，颜色、香味、脆度、营养含量、含种子数等。以对果实的品质做评价。其中四倍体葡萄果粒大，三倍体葡萄果实无核或少核，且多倍体葡萄营养物质含量较二倍体高。近年来育成的玫瑰香型葡萄品种有：“玉波一号”、“玉波二号”[20]、“早黑宝”[36]、“巨玫瑰”[17]、“晚红宝”[25]、“秋黑宝”[35]、“黑玫香”[18]，草莓香型葡萄品种有：“月光无核”[10]、“申丰”[15]、“贵园”[30]、“峰后”[31]，具玫瑰香和草莓香的品种：“玫香宝”[11]以及具蜂蜜清香味的葡萄品种“蜜红”[16]。以玫瑰香味为代表的香味葡萄深受消费者喜爱，选育香味葡萄是当前育种的又一新趋势。

3.2.5抗性

调查新品种的抗寒、抗旱、抗病虫害性，为栽培管理提供借鉴。多倍体葡萄普遍体现出较强的抗性，“沪培3号”[6]、“沪培1号”[7]、“无核早红”[8]、“红标无核”[9]、“春光”[19]、“礼泉超红”[24]、“峰后”[31]等抗病性均较强，此外“玫香宝”[11]还具有较强的抗寒性，“月光无核”[10]抗旱性强。

4 存在的问题及展望

4.1 多倍体育种

目前，已培育出一大批四倍体优良新品种，不仅生产上得到了大面积的推广，同时又作为进一步培育新品种的育种材料。如秋黑葡萄单株芽变得到大粒、淡玫瑰香味的“紫地球”[61]与比坎、玫瑰香杂交育成具浓郁玫瑰香味的“达米娜”[62]杂交育成大粒，具浓郁玫瑰香味葡萄新品种“玉波一号”、“玉波二号”[20]。但葡萄三倍体育种育成品种少，二倍体与四倍体杂交胚挽救技术还有待进一步优化[63]。在对杂交后代胚挽救时，不同杂交组合选择培养时间、培养基种类、激素种类及浓度等都需要进一步实践与摸索[38]。葡萄胚挽救试验中采用的胚发育培养时间长短不一，我们研究发现各杂交组合胚发育培养在65～95 d成苗效果较好。具香味、果肉脆甜、无核、大粒是消费者喜爱的葡萄性状，可选择无核果肉脆甜葡萄与大粒浓香型葡萄杂交，通过胚挽救技术，还可结合诱变育种技术，培育优良性状于一身葡萄多倍体新品种。此外，随着基因工程的发展和葡萄抗病、无核基因的阐明，有望实现基因工程在葡萄育种中的应用，高效培育目的性状的葡萄新品种。

4.2 种质评价

对种质的全面评价是其栽培管理、市场前景评估的重要依据。随着生物技术的不断发展，流式细胞技术可实现多倍体葡萄的早期、快速、大批量鉴定，从而提高育种效率[1]。许多育成葡萄新品种，由于未做倍性鉴定，不能确定其倍性，这大大局限了对葡萄新品种的开发利用。

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10.13414/j.cnki.zwpp.2017.04.026

2017-06-09

天津市科技计划项目（16ZXZYNC00160），天津市农业科学院院长基金（15010）。

温晓敏（1991-）,女，山西晋中人，在读硕士生，主要从事葡萄胚挽救育种研究。E-mail: 837760363@qq.com

*通讯作者：田淑芬（1966-），女，研究员，博士，主要从事葡萄栽培与选育种方面的研究。E-mail: tianshufen@263.net