韩克实 ,杨 旭,黄瑞哲△

1.西安医学院第一附属医院口腔科(西安710077)，2.西安交通大学口腔医院(西安710003)



△通讯作者

成釉细胞株ALC体外培养观察

韩克实1,杨 旭2,黄瑞哲2△

1.西安医学院第一附属医院口腔科(西安710077)，2.西安交通大学口腔医院(西安710003)

目的：探索成釉细胞株ALC的体外培养方法，了解ALC细胞的形态特征和生长特点。方法：对成釉细胞株ALC进行复苏、培养，运用免疫细胞化学SABC法检测角蛋白14和釉原蛋白的表达。结果：ALC细胞呈现特征性的“铺路石”样生长，多边形，细胞间连接紧密，细胞核明显，有短的细胞突起，符合上皮样细胞生长特点。免疫细胞化学染色结果显示角蛋白14和釉原蛋白染色阳性。结论：ALC细胞生长良好，并具有成釉细胞特点，是一种适合作为实验研究对象的成釉细胞株。

釉质的发育主要经历两个阶段，即成釉细胞合成、分泌细胞外基质以及釉基质的生物矿化。釉质的形成由成釉细胞调控，成釉细胞合成釉质基质之后，胞外基质在成釉细胞的调控下开始生物矿化。成釉细胞釉质发育分泌阶段表达的主要的釉基质蛋白是釉原蛋白，大约占有机基质的90%。牙齿发育完成需经20多种细胞的分化，要将成釉细胞经过分离、纯化后，再构建组织工程，难度较大。因此，特征性单一细胞的体外培养对牙齿发育的研究具有非常重要的意义。Nakata等取新生C57BL/6J小鼠的下颌磨牙牙胚进行组织培养，利用差别消化法分离成釉细胞后，获得了自发性永生化的成釉细胞株，命名为ALC(Ameloblast-lineage cell)[1]。

材料与方法

1 材 料 DMEM培养液(美国Hyclone)；胎牛血清(美国GIBCO)；DMSO(美国Sigma)；Amelogenin单克隆抗体(美国Santa公司)；SABC免疫组化染色试剂盒(武汉博士德)；DAB显色试剂盒(武汉博士德)；生物素化兔抗山羊IgG(武汉博士德)。

2 细胞培养

2.1 ALC细胞的复苏：迅速从液氮罐中取出细胞冻存管，立即放入37℃水浴箱中融解，不超过1 min；吸出已融解的细胞悬浮液，立即加入含有培养液的离心管内，轻轻吹打混匀后盖紧瓶盖，800r/min离心5 min；弃上清，加入6ml配好的DMEM高糖培养液，细胞吹打均匀后，移入培养皿中，37℃、5%CO2培养箱中培养24 h，观察细胞生长状态。

2.2 ALC细胞的传代：待ALC细胞铺满培养皿底壁80%～90%后，去除原培养液，4ml PBS液清洗培养皿底壁2次，并弃去PBS；培养皿中加入胰蛋白酶消化液3 ml，37℃、5%CO2培养箱中消化4 min后倒置显微镜下观察，待细胞变圆变亮时，加入3 ml DMEM高糖培养液终止消化；用移液管轻轻吹打培养皿的底壁，使细胞从培养皿底壁完全脱落并成单个分布，收集细胞悬液于离心管中，盖紧瓶盖，封口膜封口，800r/min离心5 min，弃上清；加适量含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液重悬细胞、混合均匀，按1∶3比例进行传代，将培养皿置于培养箱中继续培养。

2.3 细胞计数：取生长状态良好的ALC细胞，加入胰蛋白酶消化液3ml，置于37℃、5%CO2培养箱中，消化4min后倒置显微镜下观察，待细胞变圆变亮时，加入3ml培养液以终止消化；用细胞计数器，记录细胞数量后平均接种到24个培养皿中，按每个培养皿105个细胞接种； 24h后观察细胞贴壁情况，之后每隔6 h计数一次，每次取3个培养皿，分别计数后，求平均值。

2.4 SABC法观察角蛋白14和釉原蛋白的表达：取生长状态良好的ALC细胞制成细胞爬片，滴加适当稀释的角蛋白14抗体，4℃过夜，PBS(pH7.2～7.6)清洗，2 min×3次；滴加生物素化羊抗兔，37℃孵育 20 min，PBS(pH7.2～7.6)清洗，2 min×3次；滴加试剂SABC，37℃孵育20 min，PBS(pH7.2～7.6)清洗，5 min×4次；DAB显色，显微镜下观察，蒸馏水清洗，5 min×4次；苏木素染液复染60秒；加入梯度酒精中脱水，70%(1次，1 min)-80%(1次，1 min)-90%(1次，1 min)-无水乙醇(2次×3 min)；加入二甲苯透明，2次×1min；中性树胶封片；显微镜下观察细胞胞浆的颜色。阴性对照用PBS代替一抗进行染色，其余步骤不变。釉原蛋白免疫组化步骤同角蛋白14。

结 果

1 ALC细胞的培养状况 倒置显微镜下观察， ALC细胞呈特征性的“铺路石”样结构，卵圆形或多边形，成簇排列，细胞间连接紧密，符合上皮样细胞生长形态(见图1)。

图1 倒置显微镜下ALC细胞的形态

2 ALC细胞的生长特点 ALC细胞生长较快，贴壁后很快进入对数生长期，约24 h后进入生长稳定期，细胞数量变化不大。生长状态良好的ALC细胞在贴壁生长48h后，细胞密度可达到90%。

3 角蛋白14和釉原蛋白免疫组化染色结果 ALC细胞呈不规则多边形，胞体丰满，细胞浆丰富，胞核圆形居中，角蛋白14和釉原蛋白阳性染色细胞胞浆中可见棕黄色染色(见图2A，图3A)，阴性对照细胞胞浆中无棕黄色染色(见图2B，图3B)，说明ALC细胞表达角蛋白14和釉原蛋白。

A为阳性，B为阴性

A为阳性，B为阴性

讨 论

最初研究牙源性上皮的结构和功能，是通过体外培养牙胚的方法来获得的，后又将其从牙胚中分离出来单独研究[2]。但这些方法获得的细胞培养时间短，也难以单因素分析牙源性上皮细胞的结构和功能。于是，有学者开始进行成釉细胞的体外分离培养研究[3]。

Chen等人分离小鼠第一磨牙的成釉器上皮细胞，采用组织消化法，培养出原代的上皮样细胞，将含SV40大T抗原的质粒导入上皮样细胞中，从而获得的永生化细胞株命名为LS8，具有成釉细胞特性，如表达角蛋白和釉原蛋白等，属于分泌期成釉细胞。DenBesten等人分离幼猪未萌磨牙的成釉器上皮细胞，通过磷酸钙沉淀法将含多瘤病毒大T-抗原编码基因的质粒转入上述细胞中，所建立的成釉细胞样细胞系命名为PABSo-E，此细胞系保留成釉细胞的某些特性，如表达釉原蛋白、基质金属蛋白酶20、釉基质丝氨酸蛋白酶1等。Kawano等人建立了口腔上皮细胞系HAT-7，免疫组织化学表明，HAT-7表达釉原蛋白，成釉蛋白，碱性磷酸酶(ALP)，具有成釉细胞特性[4]。Nakata等人取新生C57BL/6J小鼠的下颌磨牙牙胚进行组织培养，利用差别消化法分离成釉细胞后，获得了自发性永生化的成釉细胞株，命名为ALC(Ameloblast-lineage cell)。ALC细胞具备成釉细胞的特性，包括体外培养时能够表达成釉细胞特异性蛋白(釉原蛋白，釉丛蛋白和成釉蛋白)，以及在体外诱导生物矿化的能力[5]。

本实验所培养的ALC细胞为卵圆形或多边形，采用含10%胎牛血清的培养液进行培养，细胞增殖能力较强，生长较快，稳定单一，形态良好。鉴定ALC 细胞时，选择了上皮样细胞的特异性蛋白-角蛋白14和成釉细胞的特异性蛋白-釉原蛋白[6-7]，ALC细胞在体外培养过程中稳定地表达角蛋白14和釉原蛋白，可认为ALC细胞为成釉细胞。ALC细胞既突破了原代细胞培养的限制，又避免了因外源基因的导入而导致成釉细胞某些重要生物学特性的改变。它们细胞均一，生长稳定，并拥有成釉细胞的各种特性，是一种适合作为实验研究对象的细胞株。

[1] Nakata A, Kameda T, Nagai H,etal. Establishment and characterization of a spontaneously immortalized mouse ameloblast-lineage cell line[J]. Biochemical & Biophysical Research Communications, 2003, 308 (4): 834-839.

[2] 王冠宇.成釉细胞的培养及其在釉质形成中的作用[J].医学综述, 2007, 13 (24): 1952-1954.

[3] 张 军,李曦光.人胚成釉细胞体外培养的实验研究[J].临床口腔医学杂志,2004,20 (4): 201-203.

[4] Kawano S, Morotomi T, Toyono T,etal. Establishment of dental epithelial cell line (HAT-7) and the cell differentiation dependent on Notch signaling pathway[J]. Journal of Geophysical Research Solid Earth,2002, 43 (2-3): 50-57.

[5] 马 林,张 颖,张凯强，等.不同浓度氟化物对体外培养成釉细胞活性的影响[J].口腔医学,2013,33(10):649-651.

[6] 田 华,吕 平,高 岩，等.钟状期成釉细胞的体外生长研究[J].牙体牙髓牙周病学杂志, 2009,19(6):309-313.

[7] 包柳郁,金 岩,牛忠英，等.人牙源性上皮细胞的体外培养研究[J].临床口腔医学杂志, 2003,19(11):643-645.

(收稿：2016-06-28)

成釉质细胞 细胞培养 体外发生 @釉原蛋白

R783.3

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.01.004