□ 刘 丽 赵媛媛 李 飞 张耀广 柴彦兵 石家庄君乐宝乳业有限公司

LC-MS检测乳制品中金霉素、土霉素、四环素的方法

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本文建立了乳制品中金霉素、土霉素、四环素的LC-MS测定方法。样品用浓度为0.1 mol/L的Na2Ed TAMcllvaine缓冲液（pH=4±0.05）提取，经过滤和离心后，上清液用HLB固相萃取柱净化，用LC-MS测定，C18毛细管管柱分离，定性离子丰度比定性，外标法定量离子定量。标准曲线相关系数在0.998 9～0.999 8，方法检出限为0.05 mg/kg，平均加标回收率在74.2%～91.4%，精密度相对标准偏差在0.77%～5.44%。结果表明所建立的方法经济、准确、可靠，适用于乳制品中四环素、金霉素、土霉素的检测。

乳制品；LC-MS；金霉素；土霉素；四环素

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

液相色谱-质谱联用仪：AGi len t126 0-AB 4000Q triP；分析天平；固相萃取装置；高速离心机；涡旋振荡器；吹氮浓缩仪；色谱纯甲醇；色谱纯乙腈；乙二胺四乙酸二钠；三氟乙酸；柠檬酸；磷酸氢二钠。

1.2 样品测定

称取牛奶样品约5 g(准确至0.0001g)于50m L具塞离心管中。

加入20 m L 0.1 mol/L NA2Ed TA-MCl l vAi n e缓冲溶液，涡旋混合1 mi n，冰水浴超声10mi n，8000r/mi n离心10mi n[1]。

准确吸取5 m L提取液（相当于1 g样品）以1滴/s的速度过H L B固相萃取柱，待样液完全流出后，依次用5 m L水和5 m L甲醇+水（1+1 9）淋洗，弃去全部流出液。2.0 kPA以下减压抽干5 mi n，最后用5 m L甲醇洗脱。将洗脱液吹氮浓缩至干（温度40℃），用1.0 m L甲醇+10mol/L三氟乙酸水溶液（1+1 9）溶解残渣，涡旋混合后，过0.22μm滤膜供液相色谱-串联质谱仪测定[2]。

1.3 标准溶液的配制

金霉素、土霉素、四环素标准储备液：准确称取金霉素、土霉素、四环素标准品各1 0.00m g，分别置于100 m L容量瓶中，用甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀。金霉素、土霉素、四环素标准液浓度为100 μg/m L。

标准工作液：根据所需浓度，用甲醇+10mol/L三氟乙酸水溶液（1+1 9）稀释至所用浓度，现用现配。

1.4 LC-MS仪器条件

1.4.1 色谱条件

色谱柱：C18（1 50m m×2.1 m m，5 μm）；柱温：30℃；流速：400 μL/mi n；进样量：5 μL。

质谱条件：电离方式：ES（+）；检测方式：多反应检测；气帘气：20 L/mi n；喷雾电压：5 500 V；去溶温度：5 50℃。

2 结果与讨论

2.1 前处理过程的优化

乳制品中含有大量蛋白质，加入0.1 mol/L的NA2Ed TA-MCl l vAi n e缓冲溶液后，冰水浴超声10mi n，能更好的沉淀蛋白，并通过高速离心得到澄清透明提取液，有利于净化过程。

2.2 流动相的选择

色谱分离一般采用甲酸、草酸或三氟乙酸水溶液,因为草酸为非挥发性酸.为使优化的色谱分离条件也适用于液质联用分析[2],本研究选择挥发性的甲酸、三氟乙酸水溶液作为流动相进行优化，甲酸水溶液作为流动相，峰型差，色谱峰拖尾，所以选用10mol/L三氟乙酸水溶液。

2.3 标准曲线

表1 质谱条件

为确定本方法适用的线性区间，设计试验测定方法的线性范围。按照方法要求，用甲醇+三氟乙酸水溶液（1+1 9）配制金霉素、土霉素、四环素含量分别为25、5 0、7 5、100、150、200n g/m L和300 n g/m L的标准曲线直接上机测定，经验证符合朗伯比尔定律。金霉素标准系列液浓度及回归方程与相关系数y=3 81x+508,R2=0.999 8。土霉素标准系列液浓度及回归方程与相关系数y=6 60x+1.01E3，R2=0.9 989。四环素标准系列液浓度及回归方程与相关系数y=868 x+2.05E3，R2=0.999 1。

2.4 方法准确度（样品回收率）

为验证方法的准确度计算平均回收率和标准偏差，分别对金霉素、土霉素、四环素5 0、100、200μg/k g附近做两个点以上的加标回收率试验。由表2可以看出三个梯度的加标回收率结果在7 4.2%～9 1.4%。其回收率符合标准要求。

2.5 方法精密度

对金霉素、土霉素、四环素5 0、100 μg/k g加标浓度样品分别做4个平行，计算相对标准偏差，将金霉素、土霉素、四环素5 0、100 μg/k g加标浓度重复测定4次，所得结果的相对标准偏差的结果在0.7 7%～5.4 4%，符合标准要求。

表2 纯奶中不同梯度金霉素、土霉素和四环素含量加标回收率汇总

3 结语

本文建立乳制品中金霉素、土霉素、四环素的LC-MS测定方法。根据乳制品的特点采用冰水浴超声和高速离心得到澄清提取液，采用色谱纯试剂最大程度减少本底的影响[3]。通过加标回收率验证该方法的准确性，重复性实验验证方法的精密度，结果表明：标准曲线相关系数为0.999 1～0.999 8，方法检出限为0.05m g/k g，标准曲线相关系数为0.9 989～0.999 8，方法检出限0.05m g/k g，平均加标回收率为7 4.2%～9 1.4%，精密度相对标准偏差在0.7 7%～5.4 4%。回收率、相对标准偏差和精密度都符合相关要求，可以快速、高效、准确检测乳制品中金霉素、土霉素、四环素。

[1]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.动物源性食品中四环素类兽药残留量检测方法 液相色谱-质谱/质谱法与高效液相色谱法(GB/T21317-2007)[S].北京：中国标准出版社,2007.

[2]吉彩霓,岳振峰,谢丽琪，等.高效液相色谱法同时检测水产品中7种四环素类抗生素残留的研究[J].中国兽医科技,2005(10):820-826.

[3]李俊锁,邱月明,王超.兽药残留分析[M].上海:上海科学技术出版社,2002.