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盐酸金霉素和超级盐酸金霉素在肉鸡体内的药代动力学和组织残留量测定

2023-08-05金庆日黄小毛魏霞丽PONGTANALERTPiyapong杨占英张君启

延边大学农学学报 2023年2期
关键词:金霉素药代灌服

金庆日, 黄小毛, 魏霞丽,PONGTANALERT Piyapong, 杨占英, 张君启

(1.杭州医学院,浙江 临安 311399;2.浦城正大生化有限公司,浙江 浦城 353400)

金霉素(Chlortetracycline,CTC)是一种具有广谱抗菌活性的四环素,用于治疗立克次氏体、支原体、衣原体、螺旋体等细菌的感染[1-2]。CTC广泛应用于动物产品体系中的疾病治疗和预防,曾被用作预混料,提高肉鸡[3]、猪[4]和奶牛[5]等动物的生产性能。CTC目前作为治疗药物和预防药物,主要以混饮方式给药[6]。然而,作为BSC(Biopharmaceutics classification system) IV类药物,金霉素具有溶解度和渗透性低的特性[7-8]。因此,提高CTC的溶解度,将有利于提高其生物利用度和在农场中的应用[9]。研究表明,通过制备其盐型[7,10]或喷雾干燥[9]制备的金霉素固体分散体可显著提高其溶解度。改变药物的体内行为(如灌服生物利用度、靶向性、透皮/透黏膜/跨血脑屏障特性等),最终可提高药物疗效,减少药物不良反应并提高服药依从性[11-14]。此外,金霉素在不同地区肉鸡中的药代动力学试验结果并不一致[3,15],有必要对金霉素进行进一步研究。该试验的目的是探究盐酸金霉素和超级盐酸金霉素在肉鸡体内的药代动力学特征以及连续给药后的残留试验,以便为金霉素和超级盐酸金霉素的临床合理应用和给药剂量的设定提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

盐酸金霉素原粉和超级盐酸金霉素由福建浦城正大生化有限公司提供。盐酸金霉素标准品购自中国食品药品检验研究院。其他溶剂和试剂均为分析级。

1.2 实验动物

体重相似的健康300日龄黄羽肉鸡40只,用于单次给药的药代动力学试验和多次给药后的残留试验。实验动物饲养于温度和湿度恒定的动物房中,动物室保持12 h的暗/光周期并提供饲料和水。肉鸡在给药前禁食12 h,允许自由饮水。

1.3 给药和采血方案

将16只健康肉鸡随机分为盐酸金霉素组和超级盐酸金霉素组,每组8只。给药前禁食12 h以上。给每只鸡灌服盐酸金霉素原粉和超级盐酸金霉素溶液,给药剂量为20 mg/kg。分别在给药后0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、10和24 h,通过翅静脉采集血样,每次采集1 mL。将采集好的全血置于肝素钠离心管中,以8 000 r/min离心3 min,收集血浆并保存于-80 ℃冰箱,直至UPLC-MS/MS分析。

其余24只也被随机分为盐酸金霉素组和超级盐酸金霉素组,以20 mg/kg剂量连续灌服7 d。第8天,用二氧化碳施行安乐死,收集肾脏、肝脏和肌肉组织样品,保存于-80 ℃冰箱,直至UPLC-MS/MS分析。

1.4 分析方法

1.4.1 血浆样品和组织样品的预处理

取100 μL鸡血浆样品,置于1.5 mL离心管中,加400 μL三氯乙酸(1 mol/L),涡旋振荡10 min,13 000 r/min离心10 min,吸取上清液。取300 μL上清液,置于样品瓶中,用UPLC-MS/MS测定血浆中金霉素浓度。

取鸡的肝脏或肾脏或肌肉组织样品5 g,加入3倍体积的生理盐水,用组织捣碎仪捣碎3 min。用0.45 μm针式过滤器过滤后,作为组织样品液。取100 μL组织样品液,置于1.5 mL离心管中,加400 μL三氯乙酸(1 mol/L),涡旋振荡10 min,13 000 r/min离心10 min,吸取300 μL上清液,置于样品瓶中,用UPLC-MS/MS测定组织中金霉素浓度。

1.4.2 液质联用仪的检测条件

色谱柱为 Waters ACQUITY UPLCTM BEH C18 Column (2.1×100 mm, 1.7 μm)和CortecsUPLCT3(2.1×100 mm, 1.6 μm),使用电喷雾电离(ESI)模式。在负ESI模式下进行分析。流动相为0.1%甲酸(A)和乙腈(B)。梯度洗脱条件为:0~2 min为90%A和10% B,2~4 min为70%A和30% B,4~6 min为5%A和95% B,6~7 min为90%A和10% B。流速0.3 mL/min,进样体积10 μL,分析时间10 min。金霉素的去簇电压30 V;金霉素的碰撞电压20 V。金霉素的母离子和子离子的质荷比(m/z)分别为 478.8和444.1。

1.4.3 药动学参数的计算

首先通过标准曲线和血浆样品的峰面积计算血浆样品中金霉素的浓度。采用WinNonlin软件的非房室模型,计算各种药动学参数,如生物半衰期(t1/2)、峰浓度(Cmax)、达峰时间(Tmax)、浓度-时间曲线下面积(AUCall)、血浆清除率(CL),表观分布体积(VZ)和平均滞留时间(MRTlast)等。

1.5 数据分析

采用SPSS软件进行分析,组间差异用t检验。P<0.05视为具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 金霉素血浆样品的色谱图

图1为血浆样品的色谱图。

A:空白血浆色谱图;B:标准溶液色谱图;C:血浆样品色谱图;D:肝脏样品色谱图

图1A为肉鸡空白血浆色谱图;图1B为金霉素标准溶液色谱图;图1C 为肉鸡灌服超级盐酸金霉素后6 h血浆样品的色谱图;图1D为肉鸡连续灌服7 d超级盐酸金霉素后采集的肝脏样品的色谱图。由图1可知,血浆样品中金霉素的保留时间为2.79 min,在组织样品中的保留时间为5.76 min。血浆样品和组织样品中的保留时间不同,与使用不同的色谱柱有关。

2.2 肉鸡灌服给药盐酸金霉素和超级盐酸金霉素后的血药浓度

单剂量(20 mg/kg)灌服盐酸金霉素和超级盐酸金霉素后血浆药物浓度和药时曲线如表1和图2所示。试验结果表明,单剂量(20 mg/kg)灌服超级盐酸金霉素后的血浆药物浓度显著高于盐酸金霉素。

表1 单剂量(20 mg/kg)灌服盐酸金霉素和超级盐酸金霉素后血药浓度

图2 单剂量(20 mg/kg)灌服盐酸金霉素和超级盐酸金霉素后的药时曲线(Mean±SE, n=8)

2.3 药动学参数的计算

用WinNonlin软件的非房室模型,计算各种药动学参数。单剂量(20 mg/kg)灌服给药后,盐酸金霉素和超级盐酸金霉素的药代动力学参数如表2所示。其中,AUCall为t0到t10 h的药时曲线下面积,AUCExtrap为根据AUClast外推得到的药时曲线下面积,MRTlast为平均滞留时间。

表2 单剂量(20 mg/kg)灌服盐酸金霉素和超级盐酸金霉素后的药代动力学参数(n=8)

单剂量(20 mg/kg)灌服超级盐酸金霉素后峰浓度为(4.69±0.54) μg/mL,显著高于盐酸金霉素(1.91±0.33) μg/mL(图2,表2)。表明超级盐酸金霉素的吸收速度快于盐酸金霉素原粉,可快速发挥药效。超级盐酸金霉素单剂量(20 mg/kg)灌服给药后AUCall为(14.51±1.20) hr·μg·mL-1,显著高于盐酸金霉素的AUCall(6.28±0.95) hr·μg·mL-1(图2,表2),表明超级盐酸金霉素到达全身血液循环的量也显著高于盐酸金霉素,有利于药物迅速到达病灶发挥药效。

2.4 残留试验

连续灌服(20 mg/kg)盐酸金霉素和超级盐酸金霉素7 d后,组织样品中盐酸金霉素的残留量测定结果如表3所示。最后1次给药后24 h,检测肌肉和肝脏中盐酸金霉素和超级盐酸金霉素的残留量接近或低于检测限(组织残留量低于10 μg/kg),远低于食用动物肌肉中盐酸金霉素的残留限量(肌肉残留限量为100 μg/kg,肝脏中的残留限量为300 μg/kg),肾组织中盐酸金霉素和超级盐酸金霉素的残留量分别为(306±58) μg/kg和(857±255) μg/kg。盐酸金霉素低于超级盐酸金霉素在食用动物肌肉中的残留限量(600 μg/kg),超级盐酸金霉素接近残留限量(表3)。

表3 连续给药7 d后盐酸金霉素和超级盐酸金霉素在组织中的残留量

3 讨论与结论

四环素类抗生素在许多国家普遍应用于人类、家畜和家禽[16]。在该试验中,单剂量(20 mg/kg)灌服盐酸金霉素和超级盐酸金霉素肉鸡的药代动力学参数如表2所示。从药时曲线(图2)和血药浓度(表1)可知,盐酸金霉素和超级盐酸金霉素均表现出双峰现象,表明大多数药物通过胆汁排入肠道,再重新吸收,具有明显的肝肠循环现象,与文献报道一致。

虽然超级盐酸金霉素和盐酸金霉素的Tmax无显著性差异,但是单剂量(20 mg/kg)灌服超级盐酸金霉素肉鸡的Cmax为(4.69±0.54) μg/mL,盐酸金霉素的Cmax为(1.91±0.33) μg/mL。此外,超级盐酸金霉素的血浆清除率(CL)低于盐酸金霉素的清除率[(1 362±110) mL·hr-1·kg-1vs (3 277±429) mL·hr-1·kg-1]。由此可见,超级盐酸金霉素可在肉鸡体内滞留较长时间,有利于长期发挥其药效。造成此差异的原因可能是相比盐酸金霉素,超级盐酸金霉素的溶解度更高,也有可能是超级盐酸金霉素的渗透速率快于盐酸金霉素。

单次灌服(20 mg/kg)超级盐酸金霉素后,血药浓度-时间曲线下面积(AUCall)显著高于盐酸金霉素[(14.51±1.20) hr·μg·mL-1vs (6.28±0.95) hr·μg·mL-1](图2)。表明超级盐酸金霉素在肉鸡血液循环中的量显著高于盐酸金霉素,肉鸡的吸收速率和吸收程度也显著高于盐酸金霉素。这可能与其溶解度和渗透性增加有关,导致其在胃肠道的吸收加快。超级盐酸金霉素的表观分布容积(VZ)小于盐酸金霉素[(4 125±378) mL/kg vs (11 197±2 592) mL/kg](表2)。表明超级盐酸金霉素在血浆中的浓度高于组织中的浓度。而盐酸金霉素的表观分布容积为10~20 L/kg,表明药物主要分布在细胞外液中。单剂量(20 mg/kg)灌服超级盐酸金霉素后的平均滞留时间(MRTlast)与盐酸金霉素类似。

此外,超级盐酸金霉素的溶解度显著高于盐酸金霉素。在灌服药物配制过程中,经过5 min的超声和2次涡旋混合后,盐酸金霉素仍有一些不溶性沉淀物,需要多次震荡混匀和超声才能完全溶解,而超级盐酸金霉素的溶解性较好。

据报道,盐酸金霉素的停药时间为2.84 d[17],肾脏的残留量应小于95%,因此在实际应用中应适当延长停药期[18]。超级盐酸金霉素具有更小、更规则的球形,增加了比表面积和与介质的接触面积,从而提高了金霉素的溶解度和溶出速率。与晶态相比,非晶态的高内能和比表面积可加快溶出速率,提高生物利用度[19]。

由于超级盐酸金霉素具有较快的吸收速度和较大的吸收程度,呈现为较高的血药浓度和生物利用度,表明超级盐酸金霉素在临床治疗中可替代盐酸金霉素。这项研究是临床试验的基础,也为临床更谨慎地使用盐酸金霉素提供了依据。给药剂量应为20 mg/kg,连续7 d混饮给药,治疗后需设定合理的停药期,以确保动物性食品的安全。

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