家畜C型肉毒梭菌脱毒干粉苗研制及免疫效果观察
2017-01-17李元新刘来利王必成冯玲霞张鹏岳
李元新 刘来利 王必成 冯玲霞 张鹏岳
（甘肃省畜牧兽医研究所，甘肃平凉 744000）
家畜C型肉毒梭菌脱毒干粉苗研制及免疫效果观察
李元新 刘来利 王必成 冯玲霞 张鹏岳
（甘肃省畜牧兽医研究所，甘肃平凉 744000）
采用具有良好免疫原性的菌株Nb6514，成功研制牛羊C型肉毒梭菌脱毒干粉苗。用其免疫牛羊血清作小白鼠体外中和试验进行免疫效果和免疫期测定。结果显示：免疫组牛羊体重可抗62000个/kg小白鼠MLD（全部健活），而对照组牛羊按体重抗17500个/kg小白鼠致死量（全部死亡），试验证实，牛羊免疫后21d左右，即可产生坚强免疫力；免疫10d的牛羊均可抗10个小鼠最小致死量/ml血清；30d分别可抗28～260和18～220个最小致死量/ml血清；180d达到高峰，分别可抗300～1500和200～1100个小白鼠最小致死量/ml血清；至550（一年半）仍可抗10个最小致死量/ml血清，结果表明免疫期在一年以上。研制的牛羊C型肉毒梭菌脱毒干粉苗具有良好的免疫效果，能有效预防牛羊C型肉毒梭菌中毒症。
牛 羊 C型肉毒梭菌 干粉苗
肉毒梭梭菌（C.botulinum），也称肉毒梭状芽孢杆菌，为自养型革兰氏阳性厌氧菌。动物C型肉毒梭菌中毒症最初由Seddon氏发现并证明，肉毒中毒分布于世界各地，多呈散发，偶有群发。我国主要分布在新疆、西藏和甘肃西部等地区，其他地区偶有散发病例，发病主要以青壮年牛羊为主，病死率高，常规治疗无效。C型肉毒梭菌苗在我省应用后，免疫效果良好，对牛羊的C肉毒梭菌中毒症得到了有效的控制。但因注射剂量大（牛10ml、羊4ml），给预防注射带来一定的困难，菌苗生产成本也较高。为此进行了牛羊C型肉毒梭菌干粉苗的试验研究，现报告如下：
1 材料与方法
1.1 种毒
中国兽医药品监察所鉴定为C型肉毒梭菌菌株Nb6514。
1.2 试验动物
试验动物：豚鼠，体重300～400g；家兔，体重1.5～2.0kg；小白鼠，体重18～22g。
1.3 菌液培养
制苗用培养基鱼（或牛）肉胃酶消化肉肝汤培养基，用玻璃瓶培养法进行生产，每ml菌液对小白鼠的致死量不低于5万个，种子培养、纯检、杀菌脱毒等方法均按部颁“规程”进行。
1.4 干粉苗的制造
在完成脱毒灭活后，采用70%硫酸铵饱和溶液提取毒素，冷冻干燥后保存分装。按14～16g小白鼠测毒培养液毒力50000MLD/ml的湿苗制苗标准，和提取干粉毒的重量折算干毒素的毒力含量，确定干粉苗每头份的干毒重量。经过计算确定出干毒重量。羊：18mg/头份，牛：每30mg/。干粉苗的稀释剂采用20%的氢氧化铝胶生理盐水。其他成品各项检验、用途、用量（用量可根据毒力提高而降低，是一个优点）等同湿苗。
1.5 成品检验
1.5.1 无菌检验：按“规程”进行，厌气肉肝汤应加新鲜生肝块。
1.5.2 安全检验：用5个免疫剂量的干粉苗注射体重300～350g豚鼠4只，观察21d。
1.5.3 效力检验：对不同批次的牛羊肉毒梭菌（C型）干粉剂苗用体重1.5～2kg家兔4只，各皮下注射1ml。21d后连同条件相同的对照兔2只，各静脉注射10个致死量的毒素，观察14d。
1.6 免疫效果测定
试验牛羊分为免疫组和对照组，干粉苗分别注射牛30mg/头和羊18mg/只，经10至20d后分别采血作中和试验，用血清能抗10个/ml小白鼠MLD用C型肉毒梭菌毒素按动物体重计量进行攻毒。
1.7 免疫期测定
用免疫牛羊血清作小白鼠体外中和试验，分别在10d、30d、180d、550d进行抗体效价测定。
2 结果
2.1 无菌检验
观察发现，接种干粉苗硫乙醇酸盐培养基（T.G）小管、酪胨琼脂斜面（G.A）和葡萄糖蛋白胨汤（G.P）及厌气肉肝汤培养基均无细菌生长。无菌检验合格。
2.2 安全检验
3批干粉苗接种检验用豚鼠后，试验豚鼠食欲正常，精神状态良好，10d后观察注射部位无坏死，均健活，安全检验合格。
2.3 效力试验
三个批次其中二个批次对10个致死量的C型肉毒梭菌毒素的保护率为100%，一个批次对10个致死量的C型肉毒梭菌毒素保护率为80%，对照组的死亡率为100%.
2.4 免疫效果测定
免疫组牛羊体重可抗62000个/kg小白鼠MLD（全部健活）；而对照组牛羊按每公斤体重抗17500个小白鼠鼠致死量，则全部死亡。试验证实，牛羊经过免疫后21d左右，即可产生坚强免疫力。
2.5 免疫期测定
结果显示，免疫10d的牛羊均可抗10个/ml小鼠最小致死量；30d分别可抗28～260和18～220个/ml最小致死量血清；180d达到高峰，分别可抗300～1500和200～1200个/ml小白鼠最小致死量血清；至550（一年半）仍可抗10个/ml最小致死量血清。从干粉苗抗体效价动力态消长规律上可以看出，免疫期在一年以上。
3 小结
（1）本项目虽用一株菌体制苗，但该菌株Nb6514和已发现其他几株c型肉毒梭菌菌株具有交叉保护作用，因此对C型肉毒梭菌中毒症具有好地预防作用。
（2）对研制的牛羊肉毒梭菌（C型）干粉苗进行了安全检验和效力检验，试验结果表明安全可靠。
（3）免疫效果测定结果显示牛羊免疫后21即可产生坚强免疫力。
（4）免疫期测定结果显示免疫期在一年以上，这对今后制定牛羊C型肉毒梭菌干粉苗的免疫程序和注射后抗体的跟踪监测提供了依据。
甘肃省农业生物技术研究与应用开发项目，项目编号：GNSW-2012-15。
李元新（1971-），男，甘肃平凉人，兽医硕士，副研究员，主要从事动物疫病防治与疫苗开发研究工作。
