万 叶，郭春燕，李永民

（河北北方学院药学系，河北张家口 075000）

帕金森病（Parkinson disease，PD）是仅次于阿尔茨海默病的第二大类神经退行性疾病，其病变特征为黑质纹状体多巴胺（dopamine，DA）神经元缺失，出现路易士小体。患者临床表现为精神症状、自主神经活动受阻和静止性震颤等［1-2］，严重影响生活质量。目前PD的治疗主要以DA替代为主，但不能阻止病程的进展［2］。构建更接近临床PD特征的模型是抗PD新药研发的重要手段。制备PD模型的药物有6-羟多巴（6-hydroxydopamine，6-OHDA）、1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP）、鱼藤酮和百草枯等［3-6］。6-OHDA不能透过血脑屏障，需直接脑内给药才能造成中枢神经系统DA神经元损伤，不能完全复制PD患者的脑病理变化，不能模拟早期PD症状［7-8］。MPTP虽可穿越血脑屏障，能模拟人和动物PD样症状，但所形成的PD呈现急性或亚急性过程，不能模拟临床PD的缓慢进展性过程［7］。百草枯虽能模拟PD患者的病理和行为学方面的部分改变，但不易穿过血脑屏障［9］。鱼藤酮具有极强的亲脂性，能透过血脑屏障和细胞膜，鱼藤酮致PD模型不仅行为学改变能接近临床PD，而且其病理学特征也与临床PD相似［10-11］。已有文献报道，通过不同方式给予鱼藤酮，可成功制备大鼠或小鼠PD模型［12-15］。另外，还可用其制备细胞模型。本文为探明PD的发病机制和新药研发提供文献基础、科研思路及方法。

1 鱼藤酮诱导PD模型制备方法

鱼藤酮诱导PD的建模方法有体内和体外方式。体内动物模型给药途径有立体定位脑内给药、静脉给药、腹腔注射给药、经皮给药、灌胃和皮肤接触给药等。体外多选PC12或SH-SY5Y细胞，也有体外培养大鼠脑切片的造模方法。

1.1 动物模型

1.1.1 脑立体定位给药

1985年，Heikkila等［16］采用脑立体定位方法用鱼藤酮制备大鼠PD模型，造成大鼠DA黑质纹状体损伤。之后，Alam等［17］采用内侧前脑束立体定位给药的方式，每只大鼠给予鱼藤酮3 μg。与假手术组相比，PD模型大鼠自发活动显著减少，强直症状显著增强，纹状体DA水平显著缺失。立体定位给予鱼藤酮第50天时，同时联合给左旋多巴和外周氨基酸脱羧酶抑制剂苄丝肼31 d，大鼠纹状体DA水平升高，自主活动改善。Saravanan等［18］立体定位于大鼠黑质密致部，采用更低剂量鱼藤酮（每只2～12 ng）制备PD模型，连续观察90 d，黑质DA水平呈时间和剂量依赖性下降，但未影响受损侧纹状体5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）水平；黑质部位谷氨酸水平呈剂量依赖性降低，酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）免疫反应阳性细胞显著减少，大鼠出现偏侧（立体定位灌注侧）PD症状。立体定位给药同样适用于不能透过血脑屏障的药物，且微量用药即有效，能模拟临床DA水平缺失，诱发PD症状。而低剂量给药，短期内5-HT含量不会发生明显变化［19-20］。立体定位给药量每只大鼠3 μg，给药8周，大鼠不仅在行为上出现运动障碍，DA、谷胱甘肽（glutathione，GSH）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）呈时间依赖性减少，5-HT水平在第8周也显著降低，且死亡率低，模型成功率高，造模剂量较为适宜。该造模方式给药微量，且一次性定位，有助于筛选治疗PD的药物。但立体定位给药操作较难，需要一定的操作能力，定位的准确性关乎实验的成败。

1.1.2 静脉给药

1997年，Ferrante等［21］静脉灌注鱼藤酮10～18 mg·kg-1连续给药10 d，发现大鼠纹状体和苍白球损伤。2000年，Betarbet等［22］给大鼠静脉注射鱼藤酮，导致大鼠出现行为障碍，黑质区域α-突触核蛋白（alpha-synuclein，α-syn）的聚集。Fleming等［23］研究表明，鱼藤酮导致大鼠运动迟缓，TH免疫活性降低，鱼藤酮剂量依赖性地降低大鼠存活率，每天2 mg·kg-1，共28 d，成功造模，且存活率相对其他大剂量的存活率高。静脉给药操作简单，药物直接进入体循环，无吸收过程，药效发挥迅速，但全身毒性较大。

1.1.3 腹腔注射给药

2002年，Alam等［24］报道，给大鼠腹腔注射鱼藤酮1.5和2.5 mg·kg-1，连续给药60 d，均能造成大鼠自主活动减少，纹状体DA含量降低，TH免疫反应性降低，并存在剂量依赖性。Bashkatova等［25］对腹腔注射鱼藤酮1.5 mg·kg-1（连续10，20，30和60 d）大鼠额叶皮质和纹状体一氧化氮（nitric oxide，NO）和巴比妥酸反应物质（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）的水平进行了观察。研究发现，第1～10天 NO和TBARS水平未升高；20 d之后，纹状体NO和TBARS水平升高；30和60 d后，纹状体和额叶皮质NO和TBARS水平均升高，且表现出自发活动减少、僵直等行为症状。2009年，Canno和Drolet等［26］进行了更长时间的观察，给不同月龄（3，7和12～14个月）的雄性Lewis大鼠腹腔注射鱼藤酮（每天2.75或3.0 mg·kg-1），各组大鼠均出现肌肉僵直、运动迟缓和姿势反射丧失等病理特征，DA神经元TH缺失，与之对应的纹状体DA水平降低，黑质DA神经元泛素化α-syn聚集。且不同月龄大鼠对鱼藤酮的时间依赖性与剂量依赖性有差异。3月龄大鼠腹腔注射鱼藤酮3.0 mg·kg-1，2 d时，约5%大鼠呈现PD症状（严重的运动性运动障碍，僵硬和体位不稳定性），直至20 d呈现PD症状大鼠数量达到75%；7月龄和12～14月龄大鼠9 d时，就有＞95%大鼠出现上述症状。7月龄大鼠剂量效应更为明显，腹腔注射鱼藤酮2.75 mg·kg-19 d时出现PD症状的比例是腹腔注射鱼藤酮3.0 mg·kg-1的1/2。因此，腹腔注射鱼藤酮不仅剂量和连续给药时间对模型结果有影响，还应考虑大鼠月龄的因素。综合文献认为，研究重点如是PD模型生物标志物和退化机制，则选用3月龄大鼠，采用低剂量1.5 mg·kg-1造模，便于观察发现PD疾病进程中各项生化指标的变化，且造模成功率与存活率高；研究重点如是药物对PD是否具有保护作用，则采用2.5～2.75 mg·kg-1。腹腔注射操作方便，吸收面积大，所复制的PD模型更接近临床PD患者的临床症状，且此方法还能制备PD的胃肠功能障碍模型［27］。

1.1.4 皮下注射

Luo等［28］报道，慢性低剂量皮下注射鱼藤酮（每天2.0～3.0 mg·kg-1），从第5～56 天，大鼠时间依赖性地出现运动功能和黑质神经元的损伤，出现类似临床PD的症状。Feng等［29］报道，大鼠皮下注射鱼藤酮造成α-syn广泛分布于脑组织，特别是海马、皮质和纹状体部位，而且选择性地造成中脑黑质和纹状体TH阳性表达降低，神经纤维缺失。Lin等［30］报道，大鼠皮下注射鱼藤酮除了造成运动功能减退、α-syn聚集、黑质和纹状体TH阳性表达降低、DA转运蛋白表达降低及DA D2受体蛋白表达升高外，还会造成蓝斑核区去甲肾上腺素神经元活性减弱。Ulusoy等［31］报道，鱼藤酮选择性地降低大鼠黑质纹状体DA水平，但不改变下丘脑DA水平。Lax等［32］研究了鱼藤酮对大鼠体温调节和运动功能的相关性，发现长期皮下注射鱼藤酮造成体温调控系统功能减弱，并且减弱程度和运动功能减弱成正相关。Binienda等［33］采用皮下低剂量（每天 1.0～2.0 mg·kg-1）注射鱼藤酮，连续注射7 d后，鱼藤酮组60%大鼠黑质DA神经元缺失，注射27 d，80%大鼠黑质DA神经元缺失，与溶媒组比较，注射7和27 d的大鼠感觉和运动神经传导速度显著变慢，提示DA缺失与感觉和运动神经传导速度减慢存在相关性。Sharma等［34］给大鼠皮下注射鱼藤酮2 mg·kg-1，1/d，连续28 d，发现纹状体DA水平降低80%才表现出PD症状，提示PD症状出现前体内已经发生了一系列的生化指标的变化。所以，PD的早期干预和治疗非常重要。皮下注射鱼藤酮35 d后，DA水平降低80%，GSH和SOD显著下降，脂质过氧化水平升高60%，这些生化指标的改变，可以作为运动功能显著恶化的标志物。在用药物进行治疗时发现，上述生化指标的改善比运动功能的改善提前3周，据此进一步推断，生化指标的改变是PD进程恶化的早期信号。2016年，Sharma等［35］报道，大鼠皮下注射鱼藤酮（每天1.5 mg·kg-1，连续28 d）导致了PD模型大鼠神经递质（DA、去甲肾上腺素、5-HT、γ-氨基丁酸、谷氨酸、二羟苯乙酸、高香草酸和5-羟基吲哚乙酸）、生化指标（过氧化脂质、GSH和亚硝酸盐）、神经炎症因子（肿瘤坏死因子α、白细胞介素1和白细胞介素6）发生变化及其运动功能也发生变化。低剂量皮下注射鱼藤酮能模拟PD的疾病进程变化和PD症状。目前多篇文献报道了给大鼠皮下注射低剂量（1.5 mg·kg-1）鱼藤酮的方法，大鼠均在第3周出现行为上的运动障碍，且能成功模拟PD的疾病进程和PD症状，更符合慢性疾病的致病过程［36-38］。此法操作简单，费用少，造模成功率高。但皮下注射会引起大鼠全身毒性，并非特异性地造成神经系统DA神经元退变，且死亡率高。

1.1.5 灌胃给药

Inden等［39］采用给小鼠灌胃的方式成功模拟了PD动物模型。连续灌胃鱼藤酮不同剂量（0.25，1.0，2.5，5.0，10和30 mg·kg-1）28 d。0.25～5.0 mg·kg-1剂量组的小鼠黑质区TH未发生明显变化，而10和30 mg·kg-1剂量组的小鼠黑质区TH变化显著。进一步实验表明，给小鼠持续灌胃给予鱼藤酮30 mg·kg-1，7 d内小鼠存活率为70%；直到28～56 d，小鼠存活率依旧为70%。而剂量增加为100mg·kg-1，连续给药56 d小鼠存活率下降为15%。灌胃给予鱼藤酮造成的DA系统受损程度、TH变化及运动功能减退等均存在时间依赖性和剂量依赖性。因此既要保证造模成功，又要保证存活率，应采用慢性灌胃给药方式造模，给予鱼藤酮30 mg·kg-1，该剂量灌胃给药有利于研究PD的疾病进程和DA神经退化机制［40］。但是，灌胃给药不仅药效较低，剂量控制不当，长期灌胃给药仍会增加死亡率，影响实验进程［40］。

1.1.6 皮下埋置缓释微球或微渗透泵给药

黄君等［41］以聚乳酸-羟基乙酸共聚物（polylacticco-glycolic acid，PLGA）为载体，将鱼藤酮制作成缓释微球，采用皮下注射鱼藤酮缓释微球的方法制作PD大鼠模型。该法只需1次给药，鱼藤酮在大鼠体内缓慢释放，造成大鼠自主活动减少，黑质致密带内TH免疫反应显著降低，黑质内绝大多数DA能神经元受损，便能模拟PD进程，但制剂过程繁琐。如能将制剂商业化，则可为科研人员提供方便。Sherer等［42］采用皮下埋置微渗透泵，大鼠每日灌注鱼藤酮2.0～3.0 mg·kg-1，成功复制了慢性摄入鱼藤酮致PD模型。该法可引起啮齿动物高选择性的黑质DA病变，黑质神经元α-syn聚集，但纹状体神经元、苍白球神经元和丘脑核未见病变。此类造模方法一次给药，药物在体内持续释放，较以往的多次给药方法方便，将微渗透泵植入体内，可实现恒定速度持续释放药物，且能减少多次给药引起的应激反应，能模拟PD进程，但微渗透泵价格贵，实验成本较大。

1.1.7 接触给药

以上几种给药方式，不仅与人接触鱼藤酮的方式存在差异，而且控制不当死亡率提高。我国学者采用模拟环境接触的方式制备PD模型取得了成功。陈乃宏实验室［43-44］将鱼藤酮溶于橄榄油，置于无垫料鼠笼中，放入C57BL/6小鼠，鼠笼置于暗处，小鼠在含有鱼藤酮的笼中自由活动2 h，给药剂量分别为每只0.1和 0.2 mg·d-1。连续给药2～6周，期间取材检测中脑α-syn含量、TH阳性细胞数和小鼠爬杆能力。0.1 mg·d-1剂量组给药后2周，模型组α-syn表达较对照组明显增加，小鼠中脑TH阳性细胞数显著减少，小鼠爬杆能力显著降低；给药4周后，模型成功率接近100%。0.2 mg·d-1剂量组造模成功时间缩短为2周，但给药4周后死亡率较高。结果表明，采用低剂量0.1 mg·d-1接触式给药4周的造模方式能使小鼠产生PD的行为学改变和相应的病理学变化，是有效的PD造模方式。该造模方式能模拟自然慢性进行性病程，不仅避免了鱼藤酮其他给药方式所造成的外周毒性，而且模型的死亡率显著降低，造模成功率提高，有助于研究PD发病机制和病程变化以及抗PD药物的作用机制。

1.2 体外模型

1.2.1 脑切片或DA神经元

Testa等［45］建立了大鼠脑切片的培养方法，并用鱼藤酮10～50 nmol·L-1作用于体外培养的大鼠脑片。结果表明，鱼藤酮浓度和时间依赖性地造成黑质致密度损伤，神经元缺失，TH水平降低。Li等［46］将鱼藤酮作用于原代培养的大鼠胚胎中脑DA神经元，E3泛素化连接酶Parkin和黄素单氧化酶1显著降低成功复制了PD模型。

1.2.2 PC12细胞或SH-SY5Y细胞

采用不同浓度的鱼藤酮（0～1000 nmol·L-1）［47-49］作用于PC12细胞或SH-SY5Y细胞，可以成功复制PD细胞模型，鱼藤酮浓度和时间依赖性地造成细胞凋亡和坏死。体外模型造模方法简单，特别是随着细胞培养技术和实时模拟人体生理环境的细胞培养仪器平台的发展，使得体外造模方法成为研究PD发病机制和药物保护机制及高通量筛选药物的主要方式。

2 鱼藤酮致PD模型的毒性机制

鱼藤酮致PD模型的毒性机制是多因素的，如α-syn异常聚集、线粒体功能异常和活性氧产生增加、抗氧化防御系统受损及细胞凋亡等，或多因素综合作用［12，14-15］。近年来研究发现，细胞内受损线粒体主要通过自噬途径降解，自噬途径的异常可阻碍受损线粒体的降解，从而导致PD发生。

2.1 诱导α -syn异常聚集

α-syn最初于1988年由Maroteaux等［50］发现，且确定其分布在神经突触前末梢和核周。在正常生理状态下，α-syn无细胞毒性，参与DA的摄取调控、神经的可塑性以及学习和记忆、维持突触结构、调节突触膜的囊泡释放和细胞黏附、维持细胞膜的结构和稳定性等［51］。当有外界损伤刺激时，α-syn的错误折叠和寡聚态增多，会产生细胞毒性。多数学者研究表明，鱼藤酮浓度和时间依赖性地造成细胞死亡，诱发α-syn聚集。研究表明，鱼藤酮作用于SH-SY5Y细胞的半数致死浓度为100 nmol·L-1。还能造成α-syn过度磷酸化，磷酸化位点与129位丝氨酸特异性的高度磷酸化有关，α-syn过度磷酸化进而影响线粒体功能和活性氧水平［52-54］。

2.2 引起线粒体功能异常（障碍）和活性氧产生增加

鱼藤酮是线粒体呼吸链复合物拉的抑制剂［55-56］，降低复合物Ⅰ的活性，破坏线粒体呼吸链的正常运转［55］，通过“渗透机制”使自由基产生增加，活性氧增加［56-58］。活性氧又引起线粒体膜通透性转换孔的打开，致使线粒体的ATP耗竭或ATP合成减少、功能衰退、膜电位下降，以及通透性增加［58-61］，细胞色素c释放。正常生理条件下，细胞色素c位于线粒体内膜，不能通过外膜。但在线粒体功能衰退；其膜通透性增加，神经元凋亡过程中，细胞色素c从线粒体释放增加，胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶9激活，胱天蛋白酶3断裂［58-61］，引起促凋亡蛋白Bax与抑制凋亡蛋白Bcl-2的比值增加［56］。抑制线粒体膜通透性开放和活性氧产生的物质，可能有助于PD的治疗［61-62］。

2.3 造成抗氧化防御系统受损

抗氧化防御系统对人体预防疾病和延缓衰老起着至关重要的作用。正常情况下，人体自由基和活性氧的生成和清除处于动态平衡，病理条件或环境因素等的改变会打破原有的动态平衡。鱼藤酮作为一种环境毒素，能破坏人体的抗氧化防御系统。已有众多学者的实验证实，鱼藤酮能显著降低超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和还原型GSH活性，增加氧化型GSH含量，降低GSH与氧化性GSH比值；鱼藤酮还能造成丙二醛显著增加［54-63］

2.4 造成细胞凋亡和细胞周期调节异常

鱼藤酮作用于SH-SY5Y细胞和SN-N-MC细胞会造成细胞周期调节异常和细胞凋亡甚至死亡［63-65］。鱼藤酮＜0.25 μmol·L-1刺激细胞，细胞周期阻滞在G1/S期，G2/M期细胞数量变化不明显；而鱼藤酮高浓度如 2 μmol·L-1刺激细胞，细胞周期阻滞在G2/M期，G2/M期之后不发生细胞分裂，而是出现核内复制［66-68］。鱼藤酮能使细胞中G2/M期关键调控分子细胞分裂周期蛋白2（cell division cycle protein 2，Cdc2）在细胞浆中的表达明显增高，且能造成Cdc2颗粒聚集；然而，细胞中的Cdc2总蛋白中Cdc2活性是降低的［66］。有学者认为，引起的G2/M期明显阻滞可能和Cdc2活性降低、Cdc2表达升高相关［66-67］。鱼藤酮立体定位给予SD大鼠，致大鼠DA神经元受损，受损神经元G1期标志性蛋白D型细胞周期蛋白表达升高，G2/M关键调控分子Cdc2表达增高，凋亡分子胱天蛋白酶3活化增加，细胞周期调控分子E2F1免疫活性增强［66］。有学者认为，Cdc2异常表达是从细胞周期阻滞到细胞死亡的一个过渡期，Cdc2表达异常，可能参与了胱天蛋白酶3和9依赖的细胞凋亡。鱼藤酮引起DA神经元细胞周期异常可能参与细胞凋亡过程［66-68］。

2.5 抑制神经细胞自噬途径

自噬是细胞内一种依赖溶酶体的物质降解途径，也是细胞在外界环境刺激以及生理病理调控下的自我保护过程，自噬不足或过度自噬都会导致细胞死亡，这也是许多疾病的重要致病机制。鱼藤酮作用于SH-SY5Y细胞和PC12细胞会造成细胞线粒体损伤，线粒体损伤是诱导PD的一个原因。Jang等［69］研究表明，鱼藤酮诱导SH-SY5Y细胞降低了其生存能力，增加了活性氧的水平，并诱导细胞凋亡和α-syn表达，且增强了mTOR表达和抑制Beclin-1表达，说明鱼藤酮抑制了自噬系统。Dadakhujaev等［70］建立了SH-SY5Y细胞系，超表达突变的α-syn诱导了一些蛋白质聚集和细胞死亡。而自噬的激活则阻断了鱼藤酮诱导的细胞死亡且减轻了α-syn变异表达细胞的线粒体膜电位损伤和鱼藤酮诱导的活性氧累积，说明自噬对鱼藤酮诱导的细胞毒性蛋白质聚集体起到清除作用。细胞内的受损线粒体主要通过自噬途径降解，因此，自噬途径的异常可阻碍受损线粒体的降解，从而导致PD发生。自噬主要的研究方法如电镜观察细胞超微结构、Western蛋白印迹法检测自噬相关蛋白、细胞免疫荧光检测自噬斑等，均已广泛应用于细胞自噬的研究［71-74］。

3 结语

综上所述，鱼藤酮产生的毒性机制与目前对PD病理机制认识相近。无论是体内还是体外，鱼藤酮都能再现人类PD的病理学特征。近年来，在鱼藤酮诱导PD模型的方法、毒性机制的研究方面都有了新的进展。梳理文献发现，相同给药方式剂量不同，造模成功所需时间不同；不同给药方式，急、慢性造模所需剂量不同，造成的病理变化和毒性机制亦存在差异。不同给药方式、不同剂量的造模各有优缺点，其生化指标、行为学变化、神经病理特征及毒性机制均有所不同，给药方式及剂量的不同都会影响实验结果，建立一个稳定、死亡率低、成模率高的模型是科研亟待解决的问题。相比之下，慢性暴露的接触式给药方式能更好地模拟人类PD自然慢性进行性的发病进程，为PD病理机制研究提供了依据，对于研究病程变化以及药物的作用机制有十分重要的意义。

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