王琳 丁楠 赵亮 张书杰 杜景华 金德龙

慢性乙型肝炎作为一种难治性疾病, 细胞凋亡在其发病机制中的作用受到关注, 而细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和自然杀伤细胞(NK)在肝细胞凋亡中发挥着重要作用［1］。由于干扰素α具有抗病毒和免疫功能双重机制, 目前, 其已经广泛用于肝病治疗［2］。本课题通过动态监测应用干扰素α治疗的慢性乙型肝炎患者在治疗前、治疗中和治疗后外周血淋巴细胞穿孔素-颗粒酶B基因和蛋白水平的变化, 结合临床,动态分析观察其与不同免疫应答的关联性, 以期阐明与之相关的免疫学及抗病毒活性的机理。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取本院在2015年12月～2016年5月间收治的20 例HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者为A组。纳入标准：①符合《慢性乙型肝炎防治指南》［3］的诊断标准；②治疗前6个月内未接受免疫调节剂和抗病毒治疗；③治疗前谷丙转氨酶(ALT)≥2×ULN。排除标准：①合并丙型肝炎病毒(HCV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)重叠感染；②药物性肝病、酒精性肝病、自身免疫性肝病；③自身免疫性疾病、精神疾病、恶性肿瘤；④妊娠或哺乳期妇女。同时选取同期来院进行健康体检的正常健康者20例为C组, 20例非活动期HBsAg携带者为B组。其中A组女10 例, 男10 例, 年龄30～70岁,平均年龄(48.5±7.2)岁；B组女11例, 男9例, 年龄31～69岁,平均年龄(49.5±6.6)岁；C组女9例, 男11例, 年龄30～69岁,平均年龄(49.1±6.7)岁。三组研究对象性别、年龄等一般资料比较, 差异无统计学意义(P＞0.05), 具有可比性。

1.2 治疗方法 A组患者给予PEG-IFNα-2b［商品名：佩乐能, SP (Brinny) Company, 注册证号S20120064］治疗, 剂量1.0 μg/kg, 1次/周, 皮下注射 , 疗程为48周。

1.3 观察指标 采用real-time PCR和Western-blot方法动态监测三组研究对象的外周血淋巴细胞穿孔素-颗粒酶B基因和蛋白的表达水平。

1.4 统计学方法 采用SPSS20.0统计学软件对研究数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示, 采用t检验；计数资料以率(%)表示, 采用χ2检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 三组研究对象治疗前外周血淋巴细胞穿孔素-颗粒酶B基因和蛋白表达水平比较 A组外周血淋巴细胞穿孔素基因表达水平为(31.54±12.43)、 颗粒酶B基因表达水平为(59.74±21.57), 穿孔素蛋白表达水平为(19.53±8.53)、颗粒酶B蛋白表达水平为(20.58±9.43)；B组外周血淋巴细胞穿孔素基因表达水平为(48.74±16.53)、颗粒酶B基因表达水平为(77.56±25.96), 穿孔素蛋白表达水平为(27.45±9.36)、颗粒酶B蛋白表达水平为(30.36±10.81)；C组外周血淋巴细胞穿孔素基因表达水平为(61.54±19.39)、颗粒酶B基因表达水平为(83.47±28.64), 穿孔素蛋白表达水平为(33.56±13.62)、颗粒酶B蛋白表达水平为(36.84±10.73)。A组外周血淋巴细胞穿孔素-颗粒酶B基因及蛋白的表达水平均显著低于B组、C组, 差异具有统计学意义(P＜0.05)；B组外周血淋巴细胞穿孔素-颗粒酶B基因及蛋白的表达水平均显著低于C组, 差异具有统计学意义(P＜0.05)。

2.2 A组治疗前后外周血淋巴细胞穿孔素-颗粒酶B基因和蛋白表达水平比较 A组治疗前、治疗后24周、治疗后48周穿孔素基因表达水平分别为(31.54±12.43)、(37.26±13.63)、(45.64±16.86), 颗粒酶B基因表达水平分别为(59.74±21.57)、(63.65±23.44)、(75.74±23.75), 穿孔素蛋白表达水平分别为 (19.53±8.53)、(23.65±9.25)、(27.35±10.21), 颗粒酶B蛋白表达水平分别为 (20.58±9.43)、(24.84±10.77)、(29.65±11.23)。与治疗前比较, 治疗后24周及48周A组外周血淋巴细胞穿孔素-颗粒酶B基因和蛋白的表达水平均显著升高,且治疗后48周显著高于治疗后24周, 差异具有统计学意义(P＜0.05)。

3 讨论

慢性乙型肝炎是一种难治性疾病, CTL和NK在肝细胞凋亡中发挥着重要作用。而穿孔素和颗粒酶B是CTL和NK的重要效应物质, 外周血淋巴细胞穿孔素-颗粒酶B的表达,实质上反映了CTL和NK细胞对乙型肝炎病毒-脱氧核糖核酸(HBV DNA)的清除能力, 外周血淋巴细胞穿孔素-颗粒酶B的表达增强, 有助于机体清除HBV DNA［4］。近年来, 临床研究通过动态监测HBV DNA、HBeAg、HBsAg等指标进行优化治疗, 以期取得更好的疗效并尽量减少病毒变异及其他不良反应。同时, 寻找预测抗病毒治疗疗效指标的探索也在不断深入, 本研究结果显示, A组外周血淋巴细胞穿孔素-颗粒酶B基因及蛋白的表达水平均显著低于B组、C组, 差异具有统计学意义(P＜0.05)；B组外周血淋巴细胞穿孔素和颗粒酶B基因及蛋白的表达水平均显著低于C组, 差异具有统计学意义(P＜0.05)。且给予干扰素α治疗后, 与治疗前比较, 治疗后24周及48周A组外周血淋巴细胞穿孔素-颗粒酶B基因和蛋白的表达水平均显著升高, 且治疗后48周显著高于治疗后24周, 差异具有统计学意义(P＜0.05)。研究发现慢性乙型肝炎患者的HBV特异性CTL在体外给予抗原肽刺激后不能增殖或增殖能力下降［5］。推测由于干扰素α具有抗病毒和免疫功能双重机制, 在清除HBV 的过程中, CTL和NK细胞是起主要作用的免疫效应细胞。激活的CTL可释放一系列毒素, 包括穿孔素、蛋白酶等细胞毒素。穿孔素和颗粒酶B相互间可起协调作用, 启动靶细胞凋亡过程［6-8］。

综上所述, 干扰素α治疗慢性乙型肝炎的机制是通过上调穿孔素-颗粒酶B介导的细胞凋亡通路而发挥抗病毒和免疫调节作用, 因此, 穿孔素-颗粒酶B可以作为评价抗病毒治疗疗效的预测指标, 为临床医生提供治疗指导。

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