张 章， 熊左隽， 范明波， 陈 文

华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院神经外科，武汉 430014



miR-128b对胶质母细胞瘤增殖、迁移和侵袭的影响

张 章， 熊左隽， 范明波， 陈 文△

华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院神经外科，武汉 430014

目的 研究miR-128b对胶质母细胞瘤增殖、迁移及侵袭的影响。方法 Real-time PCR测定miR-128b在胶质母细胞瘤细胞系U251及正常星形胶质细胞系HA1800中的表达。将U251细胞分为3组，即miR-128b类似物组、miR-128b抑制剂组及对照组，分别转染miR-128b mimics、抑制剂及microRNA scramble。转染24 h后，Real-time PCR检测3组细胞中miR-128b的表达水平。通过MTT实验、克隆形成实验测定细胞增殖；通过细胞划痕实验、Transwell小室基质渗透实验测定细胞迁移及侵袭能力。结果 miR-128b在胶质母细胞瘤细胞系U251较正常星形胶质细胞系HA1800低表达，为HA1800的(0.21±0.03)倍(P<0.01)。转染24 h后，miR-128b类似物组miR-128b较对照组表达量显著升高，为对照组的(9.16±0.85)倍(P<0.01)，miR-128b抑制剂组较对照组表达量显著降低，为对照组的(0.32±0.03)倍(P<0.01)。MTT结果示：miR-128b类似物组A490 nm值在24、48和72 h显著低于对照组和miR-128b抑制剂组；培养72 h后，miR-128b类似物组克隆形成率为(24.67±2.82)%，对照组为(52.48±5.86)%，miR-128b抑制剂组为(82.63±9.14)%，3组比较，miR-128b类似物组的克隆形成率显著低于对照组及miR-128b抑制剂组(P<0.05，P<0.01)。miR-128b类似物组、miR-128b抑制剂组及对照组划痕愈合率分别为(31.24±3.72)%、(88.74±7.52)%及(62.37±4.33)%，miR-128b类似物组的划痕愈合率显著低于对照组及miR-128b抑制剂组(P<0.05)。miR-128b类似物组、miR-128b抑制剂组及对照组侵袭细胞数分别为每个100倍视野下(278±28)个、(696±43)个及(463±37)个，miR-128b类似物组的迁移细胞数显著少于对照组及miR-128b抑制剂组(均P<0.05)。结论 miR-128b抑制胶质母细胞瘤增殖、迁移及侵袭，有望作为一个新的治疗靶点。

miR-128b； 胶质母细胞瘤； 增殖； 迁移； 侵袭

胶质母细胞瘤是一种神经系统常见恶性肿瘤[1]。尽管近年来手术、放疗及化疗等治疗手段取得了显著进步，但胶质母细胞瘤患者的平均生存时间仍只有9～12个月[2]，预后仍较差。复发和转移仍是胶质母细胞瘤治疗的难点[3]。进一步阐明胶质母细胞瘤的发病机制对研发新的分子靶向药具有重要的意义。miRNA是一种真核细胞的小RNA，长度在19～22 nt之间，其可在后转录水平与靶基因的3′端靶向结合而降解或者下调信使RNA表达[4]。miR-128b是miR-128超家族中的一员，miR-128b在多种肿瘤中异常表达，并广泛参与肿瘤生物学的各个过程[5]。然而，miR-128b对胶质母细胞瘤增殖、迁移和侵袭的影响尚不清楚。本研究在体外实验中探讨miR-128b对胶质母细胞瘤增殖、迁移及侵袭的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

胶质母细胞瘤细胞系U251及正常星形胶质细胞系HA1800购自中国医学科学院，microRNA scramble、miR-128b mimics及miR-128b抑制剂均由广州锐博公司定制合成，转染试剂Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司。

1.2 实时定量PCR

从培养细胞中提取总miRNA。按TaqMan miRNA reverse transcription kit(ABI，USA)说明书，从5 ng的总miRNA逆转录合成cDNA。miR-128b引物序列：上游引物5′-UCACAGUGAACCGGUCUCUUU-3′，下游引物5′-AGAGACCGGUUCACGGUGAUU-3′；以U6小核RNA作为内参，U6序列：上游引物5′-GTGCTCGCTTCGGCAGCACATAT-3′，下游引物5′-AAAAATATGGAACGCTTCACGAA-3′。所得产物在ABI 7500实时定量PCR仪中，使用2-ΔΔCt方法定量，计算miR-128b的相对表达量。

1.3 细胞培养、转染及分组

将U251细胞加入DMEM培养液(添加10%胎牛血清以及抗生素)，于37℃、5% CO2培养箱中培养，48 h后传代。将细胞分为miR-128b阴性对照组、miR-128b类似物组、miR-128b抑制剂组及对照组，分别转染空质粒、pcDNA6.2-GW/miR-128b mimics、DNA6.2-GW/miR-128b inhibitor及DNA6.2-GW /microRNA scramble，使用Lipofectamine 2000 reagent进行转染。转染后继续培养24 h。

1.4 MTT实验

细胞在培养箱中培养24 h后添加5 mg/mL MTT溶液40 μL，孵育4 h，每孔加入200 μL DMSO，摇床上充分振荡。490 nm波长处测定吸光度(A)值。重复3次，取平均值。

1.5 克隆形成实验

每个孔接种600个U251细胞，培养72 h后，测定克隆形成率。先去除培养液，用PBS清洗3遍，再用甲醇固定细胞20 min，然后1%亚甲基蓝染色40 min，去离子水清洗2遍，晾干。显微镜下计算大于50个细胞的克隆数量。统计克隆形成率(plating efficiency，PE)，PE%=克隆数/接种细胞数×100%

1.6 细胞划痕实验

将miR-128b类似物组、miR-128b抑制剂组及对照组细胞培养于6孔板，融合后用灭菌枪头沿直线用力划直线。划痕后即刻和48 h时在显微镜下观察细胞划痕修复情况，计算划痕愈合率。划痕愈合率=(划痕后即刻的划痕面积-划痕后48 h的划痕面积)/划痕后即刻的划痕面积×100%。实验重复3次，取平均值。划痕愈合率越高，表示细胞迁移能力越强。

1.7 Transwell细胞侵袭实验

将miR-128b类似物组、miR-128b抑制剂组及对照组各取2×104个细胞，种在Transwell小室的碳酸磷脂表面，上室BioCoatTM包被Matrigel基质胶(BD Biosciences，San Jose，CA)，37 ℃培养24 h。取出上层小室，将膜下面的细胞与1%多聚甲醛混合，用0.2%结晶紫溶液染色15 min。显微镜下计数进入膜下的细胞量，100倍视野中随机取10个视野，计算平均值。实验重复3次，取平均值。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 miR-128b在正常星形胶质细胞及胶质母细胞瘤细胞系中的表达

Real-timePCR检测显示，miR-128b在胶质母细胞瘤细胞系U251较正常星形胶质细胞系HA1800低表达，为HA1800的(0.21±0.03)倍(P<0.01)。

2.2 转染后各组U251细胞中miR-128b的表达量检测

转染24h后，Real-timePCR检测细胞系中miR-128b的表达水平，结果示：miR-128b阴性对照为对照组(0.94±0.12)倍(P>0.05)，miR-128b类似物组miR-128b较对照组表达量显著升高，为对照组的(9.16±0.85)倍(P<0.01)，miR-128b抑制剂组较对照组表达量显著降低，为对照组的(0.32±0.03)倍(P<0.01)，见图1。提示miR-128bmimics可显著提高U251细胞中miR-128b的表达量，而miR-128b抑制剂可显著降低U251细胞中miR-128b的表达量。

**P<0.01图1 miR-128b在各组中的表达Fig.1 Expression of miR-128b in each group

2.3 miR-128b抑制U251细胞增殖

MTT实验示：24h时，对照组、miR-128b类似物组、miR-128b抑制剂组A490nm值分别为(0.32±0.04)、(0.23±0.03)和(0.42±0.05)，miR-128b类似物组显著低于对照组(t=-3.117，P=0.017)和miR-128b抑制剂组(t=-5.643，P=0.002)；48h时，对照组、miR-128b类似物组、miR-128b抑制剂组A490nm值分别为(0.52±0.05)、(0.38±0.06)和(0.73±0.07)，miR-128b类似物组显著低于对照组(t=-3.104，P=0.018)和miR-128b抑制剂组(t=-6.575，P=0.001)；72h时，对照组、miR-128b类似物组、miR-128b抑制剂组A490nm值分别为(0.68±0.06)、(0.47±0.06)和(1.23±0.12)，miR-128b类似物组显著低于对照组(t=-4.286，P=0.006)和miR-128b抑制剂组(t=-9.811，P<0.001)，见图2A。

培养72h后，miR-128b类似物组克隆形成率为(24.67±2.82)%，对照组为(52.48±5.86)%，miR-128b抑制剂组克隆形成率为(82.63±9.14)%。3组比较，miR-128b类似物组的克隆形成率显著低于对照组及miR-128b抑制剂组(P<0.05，P<0.01)，见图2B。

A：A490 nm值的比较；B：克隆形成率比较；*P<0.05 **P<0.01图2 3组A490 nm值及克隆形成率比较Fig.2 Comparison of A490nm value and colony formation rate of the three groups

2.4 miR-128b抑制U251细胞迁移及侵袭

划痕48h后，miR-128b类似物组、miR-128b抑制剂组及对照组划痕愈合率分别为(31.24±3.72)%、(88.74±7.52)%以及(62.37±4.33)%。3组比较，miR-128b类似物组的划痕愈合率显著低于对照组及miR-128b抑制剂组(P<0.05，P<0.01)，见图3A。培养24h后，miR-128b类似物组、miR-128b抑制剂组及对照组侵袭细胞数100倍视野下分别为(278±28)个、(696±43)个及(463±37)个。3组比较，miR-128b类似物组的迁移细胞数显著少于对照组及miR-128b抑制剂组(P<0.05，P<0.01)，见图3B。

3 讨论

胶质母细胞瘤是颅内最常见的恶性肿瘤，发病率高，据2013年美国官方数据报道，年龄标化平均年发病率为3.19/100 000[6]，男性多于女性，发病随年龄增长而增长，并于75～84岁达到发病高峰，于85岁后发病率开始下降[7]。预后较差，中位生存时间仅9～12个月[2]。年龄、术前状态、肿瘤位置、肿瘤影像学特征及切除范围都是影响胶质母细胞瘤预后的因素[8]。得益于手术+放化疗为主的综合治疗进步，神经胶质瘤2年总生存率从10.4%增加至26.5%，中位生存时间也从12.1月增至14.6月[9]。但是术后转移和复发仍是影响预后的重要因素。

A：细胞划痕实验；B：Transwell实验(×100)图3 miR-128b抑制U251细胞迁移及侵袭Fig.3 Suppression of migration and invasion by miR-128b

近年来，miRNA被报道在多种肿瘤中异常表达，并且异常表达与诸如增殖、凋亡、迁移及侵袭等多种肿瘤生物学功能相关[10-11]。miR-128家族包括miR-128a和miR-128b，其在脑组织中表达丰富，在多种恶性肿瘤中miR-128异常表达[12]。Hu等[13]报道miR-128可通过靶向调节VEGF-C表达抑制非小细胞肺癌肿瘤形成。Shen等[14]报道miR-128可通过下调PTEN表达促进骨肉瘤细胞增殖。Katada等[15]在42例未分化胃癌组织中发现miR-128a上调表达，而miR-128b下调表达。Polytarchou等[16]报道miR-128b在乳腺癌中下调表达，并可通过调节Bmil表达抑制肿瘤干细胞生长。在胃癌中，miR-128b下调表达，并可通过靶向调节PDK1/Akt/NF-κB轴调节肿瘤细胞活动性[5]。

本研究发现miR-128b在胶质母细胞瘤细胞系较正常星形胶质细胞系低表达，同时转染miR-128b类似物组miR-128b表达量较转染阴性对照序列的对照组显著升高，miR-128b抑制剂组较对照组表达量显著降低。提示miR-128bmimics可显著提高U251细胞中miR-128b的表达量，而miR-128b抑制剂可显著降低U251细胞中miR-128b的表达量。进一步行MTT和克隆形成实验，发现miR-128b类似物组A490nm值显著低于miR-128b抑制剂和对照组，miR-128b类似物组的克隆形成率显著低于对照组及miR-128b抑制剂组，表明上调miR-128b的表达可抑制增殖，这与Wang等[17]在胃癌中的报道结果一致。

迁移和侵袭是恶性肿瘤的典型特征，是肿瘤细胞、宿主和肿瘤微环境间一系列复杂、多步骤、多因素相互作用的连续过程，这其中涉及到转化生长因子β、成纤维细胞、肿瘤相关性巨噬细胞、趋化因子、凝血酶、miRNA等一系列分子[18]。miR-128b类似物组的划痕愈合率显著低于对照组及miR-128b抑制剂组，miR-128b类似物组的迁移细胞数显著少于对照组及miR-128b抑制剂组，表明miR-128b过表达可抑制神经胶质瘤细胞迁移和侵袭。Woo等[19]在卵巢癌中发现miR-128下调CSF-1的表达，进而降低了卵巢癌细胞系的活动性和粘附能力，抑制转移，本研究结果与之一致，提示miR-128b可能在不同的肿瘤组织发挥相似的作用。但其机制目前尚不清楚，可能为通过抑制PDK1表达进而显著抑制胶质母细胞瘤的增殖、迁移和侵袭[20]。

总之，本研究首次在神经胶质瘤中发现miR-128b呈低表达，并且miR-128b高表达可抑制神经胶质瘤细胞增殖、迁移及侵袭，这为更深入了解神经胶质瘤发病机制提供了一个新的视角，并有可能为神经胶质瘤药物开发提供一个新的靶点。当然，本文也存在一定的不足，比如miR-128b在动物实验中的结果及所起的作用和机制如何，尚待进一步研究。

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(2016-08-16 收稿)

Effect of miR-128b on Proliferation，Migration and Invasion of Glioblastoma Cells

Zhang zhang，Xiong Zuojun，Fan Mingboetal

DepartmentofNeurosurgery，TheCentralHospitalofWuhan，TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430014，China

Objective To investigate the potential role of miR-128b in regulation of glioblastoma cell proliferation，migration and invasion.Methods Expression level of miR-128b in glioblastoma cell line U251 and normal astrocyte cell line HA1800 was investigated by real-time PCR.U251 cell line was divided into three groups：control group(transfected with microRNA scrambles)，miR-128b group(transfected with miR-128b mimics)and miR-128b inhibitor group(transfected with miR-128b inhibitor).MTT method and colon-formation assay were used to examine the cell proliferation ability.Cell scratch assay and Transwell assay were used to determine cell migration ability.Results Real-time PCR results indicated that the expression level of miR-128b in U251 was(0.21±0.03)folds the expression in HA1800(P<0.01).The gene expression of miR-128b in miR-128b mimics group was (9.16±0.85) times that of the control group(P<0.01)，and miR-128b expression of miR-128b inhibitor group was(0.32±0.03)folds that of the control group 24 h after transfection(P<0.01).TheA490 nmof miR-128b group was significantly lower than that of control group and miR-128b inhibitor group after culturing for 24，48 and 72 h.After 72 h cultivation，the colony formation rate in miR-128b group was (24.67±2.82)%，significantly lower than the rate [(52.48±5.86)%] in control group，and the rate [(82.63±9.14)%] in miR-128b inhibitor group(P<0.05，P<0.01).The wound healing rate was significantly lower in miR-128b group [(31.24±3.72)%] than in miR-128b inhibitor group [(88.74±7.52)%] and control group [(62.37±4.33)%] (bothP<0.05).The invasive cell number in miR-128b group was (278±28)，significantly less than(696±43) in miR-128 inhibitor group and (463±37)in control group(P<0.05).Conclusion miR-128b inhibits glioblastoma cell proliferation，migration and invasion，and might be a new potential therapy target.

miR-128b； glioblastoma； proliferation； migration； invasion

R739.41

10.3870/j.issn.1672-0741.2016.06.004

张 章，男，1979年生，主治医师，E-mail：zhangzhang8886@sina.com

△通讯作者，Corresponding author，E-mail：chenwenwuhan888@126.com