徐丹 陶陶 张继荣 古丽玲

HIF-1α对脑缺血再灌注损伤细胞凋亡及凋亡相关基因的研究进展

徐丹 陶陶 张继荣 古丽玲

缺氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor -1，HIF-1)是一种在低氧条件下发挥作用的重要转录调节因子，HIF-1蛋白α亚基受细胞内氧分压的影响，常氧条件下HIF-1α被降解而表达很少，低氧条件下HIF-1α被激活而大量表达，通过调节其下游多种效应分子的转录和表达而发挥作用，HIF-1的生物学功能由HIF-1α决定。脑缺血再灌注时可导致脑组织缺血缺氧，诱导HIF-1α表达上调，有助于机体更好地耐受低氧环境而发挥脑保护作用。本文就HIF-1α对其重要靶基因Bcl-2、Bax及Caspase-3在脑缺血再灌注损伤中的表达和调节作用做一综述，为临床以HIF-1α基因作为靶点治疗脑缺血再灌注损伤提供参考。

缺氧诱导因子-1，α亚基；脑缺血；再灌注损伤；细胞凋亡；bcl-2相关X蛋白；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3

缺氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)是 Semenza等[1]于1992年首次发现的一种能与促红细胞生成素基因相结合的核转录因子。HIF-1 是一种异二聚体复合物，由 HIF-1α和 HIF-1β亚基组成的DNA结合性蛋白分子。HIF-1β为基础表达蛋白，主要在细胞核内稳定表达；HIF-1α则受氧分压的调控，正常情况下HIF-1α的半衰期仅约5 min，低氧条件下HIF-1α的降解受到抑制，表达增加并激活下游多种靶基因而发挥作用，HIF-1 主要通过HIF-1α亚基参与组织细胞对低氧环境的适应性[2]。研究发现，轻度缺氧，即细胞内氧浓度在1%～3%范围时，HIF-1发挥抑制凋亡的作用；而长期重度缺氧时，即氧浓度在0～0.5%范围内时HIF-1α则大量表达而诱导细胞凋亡[3]。本文对HIF-1α在脑缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤中抑制凋亡的作用研究进行综述。

1 HIF-1α与脑I/R损伤

HIF-1α在多种缺血缺氧性疾病与损伤中扮演十分重要的角色，研究表明HIF-1α与脑血管疾病密切相关[4]。尽管近年来溶栓剂及血管内技术的进展降低了脑缺血的死亡率，但脑I/R损伤仍然是影响脑缺血严重程度的重要因素。脑I/R损伤时缺血中心区脑组织由于血氧供应急剧下降，导致能量供应不足，激活细胞死亡通路，神经细胞很快发生不可逆坏死，而周边的缺血半暗带区神经元由于再灌注侧支循环的建立依然具有代谢活力，其后续的死亡以细胞凋亡为主。Tominaga等[5]于1993年首先发现并证实脑缺血可引起神经细胞凋亡，随后研究人员亦发现脑缺血早期即可检测出凋亡细胞，于24 h达高峰[6]。细胞凋亡是涵盖基因调控、信号传导及凋亡效应的执行的复杂过程，对机体的生存和稳定发挥重要作用。

脑缺血使半暗带的脑血流量下降，减少了该区的氧供，诱导缺血半暗带区HIF-1α积聚活化、表达上调，有助于脑缺血后半暗带的血循环恢复和葡萄糖的运输、介导缺氧后的低氧适应，对脑组织发挥着促进细胞存活抑制凋亡的保护作用[4]。由此可见，脑I/R在导致脑组织损伤的同时也启动了自身的抗损伤机制，这种抗损伤过程可能与HIF-1α的表达上调有重要联系。HIF-1α的分布和作用十分广泛，但都与其调控下游靶基因来增强脑组织对缺氧的耐受性有关。HIF-1α参与调控的下游靶基因多达100余种，均与能量代谢或供氧有关，包括促红细胞生成素(EPO)、血管内皮生长因子(VEGF)、葡萄糖转运蛋白(GLUT)及凋亡相关基因等，HIF-1α能特异性结合这些基因上的低氧反应元件(HRE)，通过这些靶基因表达的蛋白产物来启动机体对缺血缺氧的一系列病理生理机制，如促进血管生成、调控无氧代谢、促进红细胞表达增加、帮助细胞增殖迁移分化、抑制细胞凋亡等，从而使缺氧的组织保持氧稳态[2，7]。研究人员对局灶性脑缺血动物模型研究发现，缺血半暗带区HIF-1α表达上调的同时VEGF表达亦增加，从而促进血管生成来对抗缺血缺氧性损伤，而通过实验干预减少HIF-1α的降解，则能诱导EPO及 VEGF 表达上调，明显提高红细胞携氧能力，减轻缺血后脑水肿及血管渗漏[8-9]。缺血脑组织神经元存活与否与HIF-1α的稳定密切相关，HIF-1α能在机体受到各种应激状态下对抗凋亡，促进神经元的存活，发挥脑保护作用[10]。

2 脑I/R损伤后HIF-1α与Bcl-2、Bax表达

细胞凋亡涉及多种蛋白分子的参与，而Bcl-2家族蛋白是其中不可或缺的一类蛋白质，1984年Tsujimoto等[11]从人类B细胞淋巴瘤细胞异位染色体t(14；18)上首次克隆出Bcl-2基因，迄今为止已发现并确定了Bcl-2家族的25个成员，并根据其在细胞凋亡中发挥作用的不同分为促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白两大类，两类蛋白相互协调以决定细胞是否走向凋亡[12]。生理状态下，不同家族成员在各组织中的表达量不尽相同，但其结构非常相似，具有高度同源性。Bcl-2和Bax是家族中最重要的一对调控细胞凋亡且互相对抗的因子，它们在中枢神经系统均有表达。Bcl-2是家族中的最重要的抗凋亡因子，主要在核膜、线粒体和内质网中发挥作用。Bax则是促凋亡蛋白的典型代表，与Bcl-2的同源性为21%，它以非活性形式分布于胞浆中或细胞骨架上，脑缺血早期神经细胞受到凋亡信号刺激后，Bax发生构象改变，从胞浆中转位至线粒体外膜，使线粒体通透性转变孔开放并释放出细胞色素C，细胞色素C从线粒体释放至胞浆后与凋亡蛋白酶激活因子-1(Apaf-1)和前体Caspase-9结合形成“Cyto C-Apaf-1-proCaspase-9”凋亡复合体，从而激活前体Caspase-9，活化的 Caspase-9进而激活其下游的前体Caspase-3， Caspase-3通过水解多种蛋白底物而使细胞走向凋亡。细胞色素C还可产生自由基，阻止线粒体产生ATP而诱导线粒体损伤[13]。与此同时Bcl-2与Bax结合形成异源二聚体，阻止线粒体通透性转变孔的开放，从而抑制线粒体释放细胞色素C，最终抑制Caspase级联放大反应而抑制凋亡[14]。随着I/R时间延长，机体启动凋亡机制，Bax表达增加使细胞受损加重，Bcl-2被降解而表达下调。Bcl-2抑制细胞凋亡还可能与它调节细胞内细胞器的钙离子流或发挥抗氧化作用有关[15]。研究表明Bcl-2家族蛋白对线粒体释放细胞色素C具有最明显而重要的调控效应[16]。Bcl-2 和 Bax 在细胞中根据二者的含量不同形成不同的复合物而发挥截然相反的作用，当Bcl-2的含量高于Bax二者结合形成异源二聚体时，发挥抑制细胞凋亡的作用；而当Bax的含量高于Bcl-2而形成Bax同源二聚体时，则促进细胞凋亡[17]。

大量研究证实脑I/R后相互对抗的Bcl-2和Bax的区域性表达与凋亡细胞具有同步性。Qian等[18]研究发现，抑制HIF-1α表达可使Caspase-9和Caspase-3表达上调，并抑制PI3K/Akt通路而使Bcl-2表达下调，降低Bcl-2/Bax比值。总之，脑I/R损伤诱导HIF-1α积聚活化，一方面通过上调EPO、VEGF及Bcl-2等抑制凋亡，另一方面抑制促凋亡蛋白Bax及核转录因子(NF-κB)等，还能产生抗氧化因子等来保护受损的脑组织[19-20]。

3 脑I/R损伤后HIF-1α与Caspase-3

细胞凋亡的实质是Caspase不可逆有限水解底物的级联放大反应过程，Caspase家族在细胞凋亡机制中起至关重要的作用。它们是一组天门冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白酶，与白介素-1β转换酶(interleukin-1β converting enzyme，ICE)具有同源性，家族成员均以无活性的酶原形式存在。酶原结构包括氨基端的原域，中间的大亚基(P20域)和小亚单位(P10域)3个部分。根据原域的长度，酶在凋亡途径中的位置和前体活化方式将Caspase分为两类：起始者胱天蛋白酶，包括Caspase-8、-9和-10，它们位于级联活化反应的上游，由于原域较长而能在凋亡信号的刺激下通过自剪接的方式自我激活，然后顺序激活下游Caspase而启动凋亡；效应者胱天蛋白酶，包括Caspase-3、-6和-7，位于级联活化途径的下游，它们的原域相对较短，必须通过起始者胱天蛋白酶的切割才被激活，活化后可水解胞内多种重要的功能蛋白和结构蛋白，最终使细胞走向凋亡。

Caspases蛋白酶调控凋亡主要与死亡受体途径、线粒体依赖途径及内质网通路有关。其中，在死亡受体途径中，死亡受体能与相应的“死亡配体”特异性结合，将凋亡信号传入细胞内，使Caspase-8在连接分子的媒介下通过自我剪切而活化，经过一系列的反应并最终活化Caspase-3，促进细胞凋亡。除此之外，研究发现活化的Caspase-8还能降低线粒体内膜电位使Bcl-2家族成员裂解，促进线粒体释放细胞色素C，起到凋亡放大作用[21]。在线粒体依赖中，线粒体内释放细胞色素C是最关键的一步[22]。Bcl-2家族蛋白和Caspase家族蛋白共同参与了线粒体介导的细胞凋亡途径。由此可见，Caspase家族是多条凋亡通路的聚集点，是执行凋亡的最后通路，Caspase蛋白酶不仅能自我活化还能激活其下游的家族成员，因此凋亡信号通路一旦启动，即以级联放大的形式发展，直到蛋白底物被裂解，凋亡才结束。Caspase-3是各种细胞凋亡途径的必经之路，在不同凋亡途径中扮演“凋亡执行者”的角色。在各种凋亡信号刺激下，不同的家族蛋白酶剪切并激活前体Caspase-3，使前体Caspase-3在Asp28-Ser29和Aspl75-Serl76位置处被剪切，形成P20和P10两个片段，两种亚单位再结合形成有活性的Caspase-3，活化的Caspase-3可通过以下3种机制使细胞解体：酶解细胞外基质及骨架蛋白、裂解DNA修复蛋白、降解相关凋亡抑制物[23]。

正常成年大鼠脑组织中通常具有Caspase蛋白酶的抑制剂-X染色体连锁的凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)，防止前体Caspase被偶然激活使组织细胞受损。研究证实脑缺血早期即可在缺血半暗带区检测出大量活化的Caspase-3，与凋亡细胞的表达区域一致，并于24 h表达最多，提示脑I/R损伤早期细胞凋亡与Caspase-3的激活密切相关[24]。Caspase-3的异常激活和表达上调是I/R损伤启动缺血脑区受损神经元凋亡最重要的环节，Caspase-3通过各种途径参与触发脑I/R后的细胞凋亡，而抑制Caspase-3被激活可产生明显的神经保护作用[25]。Caspase-3 还可通过水解抗凋亡蛋白Bcl-2，使其失去对线粒体通透性转变孔的抑制作用，从而发挥促进凋亡的发生[26]。脑缺血时HIF-1α不仅能通过调节Bcl-2/Bax来抑制Caspase-3，还能通过VEGF机制、TNF-α通路及ERKl/2信号通路来调控Caspase-3的活性，从而抑制Caspase级联放大反应，最终减少神经细胞损伤[27-28]。

综上所述，脑I/R损伤后，挽救缺血半暗带区的神经细胞凋亡能有效减少神经细胞坏死和神经功能缺损。大量动物实验研究已证实脑组织缺血缺氧可使缺血半暗带HIF-1α表达增加，由于HIF-1α能调控下游一系列靶基因的转录与表达，因此以HIF-1α作为脑缺血的治疗靶点所产生的疗效可能比针对单个其下游的靶基因治疗更为显著。值得注意的是，目前对HIF-1α的研究探索还停留在动物模型阶段，而且低氧条件下HIF-1α发挥神经保护作用的同时也可能促进凋亡。深入研究HIF-1α及其下游靶基因在脑I/R损伤中的表达和调控机制，充分发挥其神经保护作用并避免损伤作用，必将为今后的临床防治提供实际应用价值。

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(本文编辑：时秋宽)

10.3969/j.issn.1006-2963.2017.03.016

贵州省优秀科技教育人才省长专项基金项目[黔省专合字(2006)60号]；贵州省卫生计生委科学技术基金项目[黔卫计发(2014)41号]；贵州省科学技术基金项目(黔科合J字[2007]2096号)

550002 贵州医科大学附属人民医院康复医学科〔徐丹(现在贵州医科大学附属医院康复医学科读研究生)、陶陶、古丽玲〕；贵州医科大学附属医院康复医学科(张继荣)

陶陶，Email:835707237@qq.com

R743.3

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1006-2963(2017)03-0219-04

2016-12-02)