■ 王 燕 文奇男 刘朝银 刘 骥 郭建华 任 健 郭宏文 刘晓兰*

（1.齐齐哈尔大学食品与生物工程学院，黑龙江齐齐哈尔161006；2.辽宁省农牧业机械研究所有限公司，辽宁沈阳110036）

随着畜牧业的快速发展，蛋白质资源严重匾乏， 血粉粗蛋白含量高（80%～90%），赖氨酸、亮氨酸等氨基酸丰富[1]，还含有多种微量元素、多种酶类和维生素，因此开发血粉既可解决血液的利用问题，又能缓解动物蛋白饲料的紧缺。但是血粉适口性不好，氨基酸不平衡，因此大部分资源都浪费了。另外，血液资源由于缺乏制备血粉的烘干等设备而将这些资源作为废弃物排放掉，造成了严重的环境污染[2]。因此，血液资源的开发利用不仅缓解蛋白原料短缺的现状，还有利于保障饲料工业的可持续发展，同时可有效地缓解其对环境的污染。因此，加强对畜禽血液资源的精深加工和综合利用，研发出优质血粉产品对我国畜牧行业的可持续发展具有深远影响和重大意义。

目前血粉的加工方法主要有物理法、化学法、酶法和微生物法。物理方法包括膨化、喷雾干燥和高压处理等，这些方法能提高营养物质的安全性和利用率，仍未能解决适口性差的问题，但对氨基酸构成没有改善[3]，并且存在着高耗能、高投资等，极大地增加了养殖成本，导致其在饲料生产上的推广应用受到了限制。化学加工和酶解加工均可以改善血粉的营养特性，但制成的成品中都含有血腥味，酶解血粉成本较高，推广受到限制。微生物发酵方法是利用微生物产复合酶的特性将血粉大分子蛋白质水解成氨基酸和肽等小分子物质，并可以增加血粉中的游离氨基酸的含量，还能有效破坏血细胞膜，释放血粉中的各种营养物质或者利用营养物质合成菌体蛋白，还可以有效地利用载体中的纤维素、植酸等营养成分[4]。利用此方法制备得到的产品其消化率和适口性得到改善，发酵血粉具有酒香味，适口性好，有效降解大分子蛋白，大大提高了血粉的消化率和适口性。另外，酶解处理后蛋白的二级结构会发生改变，蛋白的二级结构主要包括α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲，酶解处理之后，蛋白的各种二级结构的含量会发生变化，导致功能特性的变化，动物利用效果提高[5]。本项目采用复合微生物协同发酵法制备肽含量高的血粉，以期提高血粉的营养价值和利用率，更有效地替代鱼粉等优质蛋白饲料。

1 材料方法

1.1 试验菌种

米曲霉、枯草芽孢杆菌，齐齐哈尔大学生物工程实验室提供。①PDA培养基：土豆汁（30%浓度配制），2%葡萄糖，自然pH。②LB培养基：1%胰蛋白胨、0.5%酵母浸膏、1%氯化钠，自然pH。

1.2 生长曲线的绘制

依据单菌筛选出的菌种，挑选斜面上生长良好的部位，各接种一环到装有100 ml种子培养基的250 ml的三角瓶中，以37℃、180 r/min恒温振荡培养24 h。将培养好的种子液接入到装有250 ml种子培养基的500 ml的三角瓶中，每瓶接入15 ml种子液，每种菌设置1个重复。将接种好的三角瓶于37℃、180 r/min恒温振荡培养，每隔4 h每瓶取5 ml菌液，5 000转离心10 min，弃上清液。再往离心管内加入40 ml蒸馏水，振荡，使沉淀变成悬浊液，以蒸馏水为对照，在600 nm下测定吸光值。以培养时间为横坐标，吸光值的平均值为纵坐标，绘制生长曲线。菌种计数采用平板计数法。好氧菌采用涂布平板法，兼性厌氧菌采用倾注平板法。

1.3 发酵条件的优化

按照单因素试验设计，分别优化发酵培养基的比例、物料比、发酵温度、培养时间以及辅料添加比例，起始条件为菌种比例为1∶1，物料比为5∶5，温度30℃，发酵时间64 h，料水比1∶2，pH值自然。酶活的测定方法参照国标[6]。

2 结果与讨论

2.1 米曲霉和枯草芽孢杆菌的生长曲线(见图1、图2)

图1 米曲霉生长曲线

图2 枯草芽孢杆菌生长曲线的测定

由图1可以看出，从0～8 h时菌体处于生长延滞期，这一时期是菌体吸水膨胀、子囊消失的过程，8～24 h时菌体处于对数生长期，在24～28 h时达到菌体生长的稳定期。对数生长期是菌体具有较高的繁殖能力的时期，所以选择20 h为最佳的种子培养时间，此时的菌体浓度为23.60 mg/ml。

由图2可以看出，0～12 h枯草芽孢杆菌生长旺盛，12～16 h枯草芽孢杆菌生长下降，16～20 h生长缓慢上升，20～24 h又下降。所以可以看出生长12 h时枯草芽孢杆菌生长最旺盛，此时的菌体浓度最大，为12.53 mg/ml，所以选择12 h为枯草芽孢杆菌的液体种子培养的最佳时间。

2.2 最佳发酵条件的优化

2.2.1 最佳物料的优化(见图3)

图3 血粉与辅料的最适比例

由图3可知，物料比血粉与麦麸5∶5时发酵效果最好，这与麦麸本身的透气性好有关。对于米曲霉这类好氧菌，添加麦麸能提高物料的通透性，使氧气与菌种能充分反应，促进菌体的生长和增殖。加入快速碳源一般应加快反应，但在本试验中，快速碳源（蔗糖）对产酶性能有一定的阻遏，可能是微生物胞外酶生物合成的分解代谢产物的阻遏效应，在快速碳源存在的条件下，组成酶和诱导酶都有类似的现象。显然，蔗糖对米曲霉和枯草芽孢杆菌产蛋白酶的阻碍属于代谢产物阻碍。

2.2.2 最佳主辅料比的优化(见图4)

由图4可知，血粉和麦麸的比例为5∶5时，蛋白酶活力最高。当麦麸含量逐渐增加时，蛋白酶活力逐渐增加，这可能是由于麦麸一般情况除了增加物料的通透性，提供充足的氧气外，还会提供碳源，此时的碳氮比能最大限度地增加微生物的增殖，随着微生物数量的增加，产酶活力必然会逐渐加大，便于微生物发挥作用。

图4 血粉和麦麸的比例优化

2.2.3 最佳料水比的条件优化(见图5)

图5 最适料水比的条件优化

由图5可知，料水比为1∶2时蛋白酶酶活力较高，且与1∶2.5、1∶3.5的比例的蛋白酶酶活无显著差异，随着水的增加，微生物的增殖能力和产酶能力都相应提高。合适的湿度能改善物料的理化性质，促进菌体生长，提高酶活，一般高于70%较为适宜，对于细菌，一般要求70%为宜，而真菌对湿度要求较高，20%～70%之间为宜。为了降低成本应选择1∶3.5作为最适比例。但是水含量过高，物料无法满足微生物的营养要求，会使蛋白酶活下降。

2.2.4 最佳发酵温度的优化(见图6)

由图6可知，随着发酵温度的增加，蛋白酶酶活呈现先增加后减小的趋势，当发酵温度为36℃时，蛋白酶酶活达到最高值为4 114.93 U/g，温度主要影响的是菌体生长和底物湿度，温度越高，相对湿度就越小。本文采用的微生物是米曲霉和枯草芽孢杆菌，米曲霉的最适温度为30℃，细菌的最适温度为37℃，两种菌达到更好的生长和产酶效果，最适温度应该介于两者之间，这与本文得到的结论是一致的。随着温度的继续增加，酶活力迅速下降。

图6 随发酵温度的升高蛋白酶酶活的变化

2.2.5 最佳发酵时间优化

从24～36 h，酶活变化较大，从36～48 h酶活变化不大，从培养36 h开始，产酶速度加快，到72 h达到产酶最高峰，然后开始下降，且下降幅度较大，说明发酵受到时间的影响较大。发酵时间主要影响菌体的生长和酶活，在固态基料中传质较液态基料慢，由本文可以看出，随着发酵时间的延长，蛋白酶酶活逐渐增加，72 h达到峰值，发酵到84 h反而酶活下降，可能是养料已经消耗殆尽，产生了其他的副产物消耗了其中的蛋白酶。

图7 随发酵时间的延长蛋白酶酶活变化

Wang等[7]采用米曲霉固态发酵猪血和麦麸的混合物，120 h后，肽的含量显著增加，俞炜洋等[8]采用产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌和乳酸菌等多种蛋白酶使发酵产品具有醇香味，适口性得到改善，发酵后产生小肽和氨基酸。这些研究与本文得到的结论是一致的。方俊等[9]筛选到高产蛋白酶的菌株，通过米曲霉、酿酒酵母和芽孢杆菌使蛋白酶活力达到2 991.4 U/g，经血粉发酵检测，该混合菌有较强的蛋白分解能力，能降解血粉和羽毛粉中难以分解的大分子蛋白。张滨等[10]采用蜡样芽孢杆菌、乳酸菌和酵母菌进行多菌种混合发酵血粉，显著提高了蛋白酶活力（5 113.4 U/g）。但是以上研究显然酶活低于本试验的结果，这与选择的菌种和发酵工艺条件有关。与单菌株单独发酵相比，多个菌株协同生长更快，发酵周期更短，多菌种混合发酵玉米蛋白粉能产生大量的发酵副产物，大大改善了血粉的气味，提高了血粉的适口性。

3 结论

酶解血粉最佳的发酵工艺条件为最优的物料是麦麸，血粉和麦麸比例是5∶5，料水比是1∶3.5，发酵温度是36℃，发酵时间是72 h，达到最高酶活是6 122.08 U/g。