王长明，张金菊，徐平，刘海军，魏志杰，张丽

(遵义医学院附属医院，贵州遵义563003)

不明原因脑炎患者脑脊液HCV-E1基因片段检测

王长明，张金菊，徐平，刘海军，魏志杰，张丽

(遵义医学院附属医院，贵州遵义563003)

目的 探讨丙型肝炎病毒(HCV)与不明原因脑炎的关系。方法 不明原因的脑炎患者48例，丙型肝炎患者及HCV携带者共25例，采用荧光定量PCR和巢式PCR技术检测其脑脊液中的HCV-E1基因片段。结果 48例不明原因脑炎患者中有6例脑脊液HCV-E1基因片段阳性，25例丙型肝炎患者及HCV携带者均为阴性，两者相比，P<0.05。6例不明原因脑炎患者脑脊液中检测到的HCV-E1基因片段测序结果与标准毒株相符。结论 HCV与部分不明原因脑炎的发病可能有关。

脑炎;病毒性脑炎；丙型肝炎病毒；丙型肝炎病毒-E1基因片段

丙型肝炎病毒(HCV)主要损害肝脏，表现肝炎的临床症状及体征。HCV还可能会损害中枢神经系统，破坏神经细胞，导致人类某些神经疾病的发生，在部分国家和地区曾引起短暂爆发流行[1]。在我国，存在较多散发的、病因较难明确的病毒性脑炎。为寻找病因，临床上常检测脑脊液(CSF)中的抗体、病原体及基因片段。检测到病原体是颅内感染诊断的金标准，但对于病毒感染性疾病，要检测到病原体极其困难。因此，检测抗体及基因片段的方法被广泛采用。但由于抗体的产生有窗口期，其检测也受到限制。我们常采用PCR技术检测CSF中的基因片段，用于颅内感染的诊断。但由于CSF细胞总RNA含量低、容易降解，用常规PCR技术和单纯荧光定量PCR技术检测CSF中的基因片段非常困难。为了探讨部分不明原因脑炎是否与HCV感染有关，我们收取48例不明原因脑炎患者的CSF，提取其中的单个核细胞总RNA，设计、合成了检测HCV的引物和探针，采用荧光定量巢式PCR技术对其HCV-E1基因片段进行了检测。现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2012年10月～2015年5月遵义医学院附属医院收治的原因不明脑炎患者48例，男31例，女17例；年龄(35±8)岁；发病后7 d内采集CSF。48例患者的临床症状、体征、CSF检查结果、血液生化及常规检查结果、细胞学检查结果、脑电图及影像学检查结果等均符合脑炎的表现，且其CSF中单纯疱疹病毒、EB病毒、乙型脑炎病毒、HCV、带状疱疹病毒特异性抗体检测均为阴性，脑炎病因不能明确。排除脑炎发病7 d以上的患者、颅内有明确梗死灶和出血灶的患者、病原学诊断明确的颅内感染患者。遵义医学院附属医院同期收治的丙型肝炎患者及HCV携带者共25例，男14例，女11例；年龄(30±3)岁；丙型肝炎发病后、HCV携带确诊后7 d内采集CSF。

1.2 HCV-E1基因片段的检测 采用荧光定PCR和巢式PCR技术。利用计算机Primer Express2.0

软件辅助设计引物探针。HCV-E1外引物244 bp、内引物63 bp，序列如下：内引物中正向引物为5′-GATGCCATCCTGCACACTCC-3′、反向引物为5-AGTGGCGCCTGGGAGAGA-3′，外引物中正向引物为5′-CACCAGGGACGGCAAACT-3′、反向引物为5′-CTCCCGACAAGCAGATCGA-3′，Probe引物为5′-FAMCCCACAACGCAGCTTCGACGTCAT-TAMRA-3′。引物探针由Invitrogen公司用ABI 3900台式高通量DNA合成仪合成。①CSF中单核细胞(CSFMC)RNA提取：每例受检者采集CSF 5 mL，4 ℃、3 000 r/min离心(半径10 cm)10 min，弃上清液。将分离的CSFMC中加入1 mL的PBS 稀释，加TRIzol并振荡15 s，再加200 μL的氯仿并振荡15 s，室温静置5 min，4 ℃、12 000 r/min离心15 min。取离心后的上清液0.5 mL，加入另一离心管中，加0.5 mL的异丙醇，轻轻摇匀，-20 ℃沉淀30 min，然后在4 ℃、12 000 r/min离心15 min，丢弃上清液，加入1 mL用 DEPC水配制的75%乙醇，洗涤RNA后沉淀、混匀，再次4 ℃、12 000 r/min离心5 min。小心缓慢吸去乙醇，在真空或空气中干燥5～10 min，加入DEPC水30 μL溶解RNA，-80 ℃冰箱保存备检。如需要长期保存，则需加入2.5倍体积乙醇，-80 ℃下保存。②RNA逆转录及cDNA扩增:采用荧光定量巢式PCR技术，用美国BIO-RAD 定性PCR仪。逆转录反应取4 μL的RNA作为模板。PCR反应体系：10 μL的RNase Freed H2O，1 μL的Prime ScriptTMRT Enzyme Mix I ，1 μL的Oligo dT Primer ，2 μL的5×Prime ScriptTMBuffer (for real time)， 4 μL的RNA ，2 μL的Random 6 mers ，总体积为20 μL。反应条件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。外引物定性反应：取4 μL的cDNA模板做定性扩增，仪器为C1000 Thermal cycler(美国BIO-ARD公司)，每例份反应体系：32 μL的H2O ，10 μL的5×定性 buffer ，1 μL的dNTPS，1 μL的TAQ，1 μL的Reverse Primer，1 μL的Forward Primer(外)，4 μL的cDNA ，总体积50 μL。PCR buffer成分：50 mmol/L的KCl, 2 mmol/L的 MgCl2，10 mmol/L的Tris-HCl(pH 8.0)。反应条件：93 ℃ 5 min， 93 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共40个循环，72 ℃ 7 min。荧光定量PCR反应：待测样本每例份按以下反应体系进行，25 μL的H2O，2.5 μL的10×PCR buffer，0.5 μL的dNTPS，0.5 μL的TAQ，0.5 μL的Forward Primer，0.5 μL的Probe，2 μL的cDNA，总体积25 μL。反应条件：93 ℃ 2 min，93 ℃ 15 s，55 ℃ 25 s，72 ℃ 25 s，共40个循环。③基因克隆测序：阳性PCR 产物用醋酸钠、乙醇沉淀法纯化后与T载体连接，转化大肠杆菌。鉴定筛选重组子采用菌落-FQ-PCR及蓝白斑，同时收集每例份标本阳性菌落进行培养。收集菌落，提取质粒DNA，重新采用FQ-PCR进行鉴定，对阳性质粒重组子进行基因测序(广州蓝吉生物工程有限公司)。

1.3 统计学方法 采用SPSS22.0统计软件。数据比较用Fisher精确概率法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

48例不明原因脑炎患者中有6例CSF中的HCV-E1基因片段阳性，25例丙型肝炎患者及HCV携带者则均为阴性，两者相比，P<0.05。经BLSAT软件分析证明6例不明原因脑炎患者CSF中检则到的HCV-E1基因片段序列与基因库HCV-E1基因片段序列一致，见图1。

图1 1例不明原因脑炎患者CSF中检测到的HCV-E1克隆的核苷酸序列测序结果(160～220为基因组序列)

3 讨论

HCV为黄病毒科，病毒体直径<80 nm，呈球形，在核衣壳外有含脂质的囊膜包绕，有剌突在囊膜上形成[2]。HCV基因有一开放可读框架在5′端非编码区下游，基因组排列顺序5′-C-E1-E2/NS1-NS2-S3-NS4-NS5-3′，编码的多聚蛋白前体有3 014个氨基酸，该多聚蛋白前体经病毒自身蛋白酶和宿主细胞作用，裂解为E1、C和E2/NS1三种独立结构的糖蛋白[3]。作为细胞内转录调节因子，核壳蛋白可能与肝细胞损害以及肝癌发生有关。另外还有参与病毒复制与装配的四种非结构蛋白NS2、NS3、NS4、NS5，其中NS2和NS4与细胞膜紧密结合在一起，但其功能尚不清楚。具有螺旋酶活性的NS3蛋白参与解旋HCV-RNA分子，在RNA复制中起协助作用。NS5依赖于RNA的聚合酶活性参与HCV基因组复制。E1和E2分别是HCV的两个膜蛋白，E1具有高度保守性，E2可能是HCV基因组中最高可变区域。因此，E1、NS5对HCV诊断试剂盒的开发及疫苗研制具有很好的靶位潜力[4,5]。

文献[2]报道，部分神经系统疾病患者的血液和CSF中发现HCV抗体或抗原阳性，间接提示部分中枢神经系统的损害可能与HCV感染有关。研究[6]认为HCV导致中枢神经系统功能受损的症状及体征机制可能是HCV与星形胶质细胞和神经元相互影响，如Fujita等[7]曾报道1例34岁男性患者，出现定向力障碍及精神行为异常等神经系统受损的症状和体征，CSF生化、常规检测以及细胞学检查均呈中度异常，脑电图表现为较多的弥漫性慢波，给予无环鸟苷抗病毒治疗后，定向力障碍及精神行为异常症状逐渐改善，但却出现肝脏损害症状及体征如黄疸、肝区疼痛和谷丙转氨酶增高等，同时其血清HCV-RNA阳性，但CSF中HCV-RNA阴性。分析其原因可能是HCV在CSF中浓度通常在100拷贝/mL以下，浓度过低，应用常规PCR技术无法检测到。Laskus等[8]采用套式RT-PCR技术检测了13例HCV肝炎患者的CSF，其中8例HCV-RNA阳性，但是这些患者没有神经系统症状及体征，只能说明HCV在CSF中被复制，不能明确其能否导致中枢神经系统疾病。王振海等[9]采用FQ-nRT-PCR技术检测了病毒性脑炎患者及健康人的血液和CSF中HCV-RNA基因片段，其中46例病毒性脑炎患者中4例血液、3例CSF中HCV-RNA基因片段阳性。该研究检测到的HCV-RNA基因片段阳性率低，而且没有明确其检测片段是否稳定、保守，不易判定假阳性及假阴性。

尽管上述文献报道有部分神经系统疾病患者的血液和脑脊液中HCV抗体、抗原以及基因为阳性，这只能间接提示中枢神经系统的损害可能由HCV导致，却没有直接证据能够表明HCV可损害中枢神经系统，并导致中枢神经系统的功能障碍。本研究采用荧光定量PCR技术，对不明原因病毒脑炎患者的CSF和丙型肝炎患者及HCV携带者的CSF中高度保守的HCV-E1基因片段进行了检测，结果显示48例不明原因病毒性脑炎患者，6例CSF中检测到HCV-E1基因片段，克隆测序经BLSAT软件分析证明为HCV-E1基因片段，与基因库HCV-E1序列一致。本研究检测的阳性率(12.5%)明显高于文献[7]报道的8.69%，可能是HCV-E1具有高度保守性，从而提高了检测的可靠性。6例HCV-E1基因片段阳性的不明原因病毒性脑炎患者的血液HCV抗体为阴性，可能因感染HCV后抗HCV抗体出现较慢，而HCV-RNA在暴露后的1～2周才易被检出所致[10,11]。检测到HCV-E1基因片段的患者可能近期被HCV感染。

本研究中48例不明原因病毒性脑炎患者单纯疱疹病毒、EB病毒和乙型脑炎病毒、带状疱疹病毒特异性抗体检测均为阴性，6例CSF中检测到HCV-E1基因片段，说明HCV与部分不明原因脑炎的发病可能有关，而且近期被HCV感染的可能性较大。由于经费有限、样本量少，本研究未能对HCV-E1基因片段阳性者的CSF进行原位PCR检测，不能判定HCV-E1基因片段为阳性的脑炎患者即为HCV感染致病。下一步我们将扩大样本量，对HCV-E1基因片段阳性CSF进行原位PCR检测，进一步明确HCV感染与不明原因脑炎的关系。

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遵义医学院硕士启动基金资助项目(201106)。

王长明(E-mail: wangchangming3@sina.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.43.024

R734.02

B

1002-266X(2016)43-0073-03

2016-08-02)