韩清珍，徐杰，张险峰，钱雪峰，章杨，史进方，仇惠英

(1苏州大学附属第一医院临床检测中心，江苏苏州215006；2苏州大学附属第一医院江苏省血液病研究所)

万古霉素依赖性屎肠球菌的生物学特性观察

韩清珍1,2，徐杰1，张险峰1，钱雪峰1，章杨1，史进方1，仇惠英2

(1苏州大学附属第一医院临床检测中心，江苏苏州215006；2苏州大学附属第一医院江苏省血液病研究所)

目的 观察万古霉素依赖性屎肠球菌(VDEfm-1501)的生物学特性。方法 1株从1例血液病患者尿液中分离到的依赖万古霉素生长的VDEfm-1501，先用VITEK 2细菌鉴定仪对其进行菌种鉴定，之后用PCR法和VITEK MS质谱鉴定法对其进一步验证。E-test法检测VDEfm-1501万古霉素依赖生长特性及生长所需的最低万古霉素浓度；K-B法检测VDEfm-1501耐药性；PCR法检测VDEfm-1501耐药基因；多位点序列分型法对VDEfm-1501进行序列型(ST)分型；PCR法对VDEfm-1501的D-丙氨酸连接酶基因(ddl基因)进行测序。结果 随着VDEfm-1501传代次数增多其万古依赖性逐渐减弱，传至第5代时这种依赖性不再明显，第6代时几乎完全消失； VDEfm-1501正常生长至少需要1.0 μg/mL的万古霉素。VDEfm-1501对氨苄青霉素、庆大霉素及环丙沙星耐药，仅对利奈唑胺和四环素敏感；VDEfm-1501携带庆大霉素耐药基因[ace(6′)-Ie-aph(2″)-la基因]。VDEfm-1501为耐万古霉素的肠球菌(VRE)ST型，属于CC17克隆复合体。VDEfm-1501的ddl基因942 bps位置上插入了“GG”。结论 VDEfm-1501依赖万古霉素生长的特性容易丢失，其生长所需的最低万古霉素浓度为1.0 μg/mL。VDEfm-1501多重耐药，携带耐药基因ace(6′)-Ie-aph(2")-la基因。VDEfm-1501属于VRE的ST型。ddl基因942 bps位置上“GG”的插入导致了VDEfm-1501的出现。

肠球菌；耐万古霉素的肠球菌；万古霉素依赖性肠球菌；屎肠球菌；万古霉素依赖性屎肠球菌；万古霉素；替考拉宁

万古霉素依赖性肠球菌(VDE)是指只有在万古霉素、替考拉宁等糖肽类抗生素存在的条件下才能生存的肠球菌，由耐万古霉素的肠球菌(VRE)突变而来。自1994年全球第1株VDE被报道以来[1]，先是美国、英国等发达国家报道[2]检出VDE；近十几年来相继在印度、巴西等发展中国家也分离到了VDE[3,4]；近几年随着糖肽类抗生素的广泛使用，VRE的检出率不断上升[5]。但到目前为止在我国还未见有关VDE的详细报道。2015年6月，我们从1例血液病患者的尿液中培养分离到了1株依赖万古霉素生长的屎肠球菌，命名为VDEfm-1501。我们对这株VDEfm-1501鉴定后，观察了其物学特性。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 VDEfm-1501来自1例血液病患者的尿液，该患者为51岁女性，患骨髓增生异常综合征，2015年6月20日因血细胞三系进行性下降由外院转入苏州大学附属第一医院。该患者入院前因发热静脉滴注亚胺培南11 d、替考拉宁6 d；本次入院后第1天的尿常规检查提示白细胞(109/μL)升高(正常为0～28/μL)，疑为尿路感染，第2天送检尿培养，同时静脉滴注头孢地嗪和左氧氟沙星、口服制霉素片；6月26日尿常规检查结果恢复正常后停用左氧氟沙星，制霉素片和头孢地嗪作为预防用药一直沿用至7月15日；6月26日尿培养发现了VDEfm-1501。

1.1.2 试剂和仪器 哥伦比亚血琼脂平板，巧克力血琼脂平板，MH药敏试验琼脂平板，药敏纸片，自制菌株保藏基质，甘油与蒸馏水混合配制15%甘油，核酸提取和纯化试剂盒，Taq酶、DNA marker DL2000及其他PCR相关试剂。PCR引物合成、基因测序由上海生工生物工程有限公司完成。VITEK 2细菌鉴定仪，GeneAmp PCR System 9700 PCR仪。

1.2 方法

1.2.1 VDEfm-1501的鉴定及其抗生素敏感性试验 利用VITEK2细菌鉴定仪对VDEfm-1501进行鉴定，同时利用K-B法进行抗生素敏感性试验，质控菌株为金黄色葡萄球菌ATCC25923(纸片扩散法药敏试验的质控菌株)。之后，用PCR法和VITEK MS质谱鉴定法进一步对VDEfm-1501进行验证。PCR简要步骤：用PCR试剂盒提取VDEfm-1501的核酸作为模板，借助屎肠球菌(E. faecium)和粪肠球菌(E. faecalis)的特异性鉴定引物用PCR方法进一步验证[6]。

1.2.2 VDEfm-1501万古霉素依赖生长特性及生长需要的最低万古霉素浓度观察 挑取VDEfm-1501菌落，配备0.5麦氏浊度的菌液，涂布法将其接种于MH药敏试验琼脂平板，贴万古霉素纸片验证其万古霉素依赖生长特性，并观察传代第3、4、5、6次的VDEfm-1501是否依然聚集在万古霉素纸片周围生长，判断其万古霉素依赖生长特性的稳定性；同时利用万古霉素E-test纸条检测VDEfm-1501生长需要的最低万古霉素浓度。

1.2.3 VDEfm-1501耐药性观察及耐药基因检测 K-B法检测VDEfm-1501耐药性，参照 CLSI 2015抗菌药物敏感性试验纸片法执行标准初步判定其耐药情况。采用PCR法检测 VDEfm-1501的耐药基因，包括糖肽类耐药基因(vanA、vanB基因)、庆大霉素耐药基因[(ace(6′)-Ie-aph(2″)-la基因]、四环素类耐药基因(tetM基因)和金黄色葡萄球菌β-内酰胺酶类耐药基因(tem基因)[7]。

1.2.4 VDEfm-1501的分型 采用多位点序列分型(MLST)法。提取VDEfm-1501基因组DNA，PCR法分别扩增7个管家基因，即腺苷酸激酶基因(adk基因)、ATP合成酶α亚基基因(atpA基因)、D-丙氨酸连接酶基因(ddl基因)、6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因(gdh基因)、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(gyd基因)、磷酸腺苷结合盒转运体基因(pstS基因)、磷酸核糖胺咪唑羧化酶基因(purk基因)[8]。PCR产物双向测序，产物序列与屎肠球菌MLST数据库(http://efaecium.mlst.net/)数据比对，依次获得等位基因号、序列型(ST)。

1.2.5 VDEfm-1501的ddl基因突变分析 以Enterococcus faecium DO(NC_017960.1，VRE)基因组序列为参考，在ddl基因编码框外侧设计特异性引物ddl-O-F(5′-TGAACGATTTAGAATACAG-3′)、ddl-O-R(5′-ACGCAATCACTCCAGCCTC-3′)，以提取的VDEfm-1501 DNA为模板，扩增ddl基因(1 141 bps)，PCR产物双向测序，产物序列与美国国立生物信息中心数据库(https://blast.ncbi.nlm.nihgov/Blast.cgi)数据比对。PredictProte(https://www.predictprotein.org/)生物信息软件预测ddl蛋白的结构。

2 结果

2.1 VDEfm-1501的鉴定结果 患者尿液接种过夜后，在血平板上发现了二十几个类似肠球菌的菌落，VITEK 2鉴定为屎肠球菌，K-B法药物敏感性试验显示该菌围绕万古霉素和替考拉宁纸片聚集生长，远离这两种纸片的部位几乎无该菌生长。PCR法和VITEK MS质谱鉴定仪鉴定结果均为屎肠球菌。

2.2 VDEfm-1501万古霉素依赖生长特性及生长需要的最低万古霉素浓度 VDEfm-1501在普通血平板上生长很差，菌落小且分布稀疏；VDEfm-1501在含万古霉素的巧克力平板上可以正常生长；VDEfm-1501在MH药敏平板上只围绕万古霉素或者替考拉宁纸片生长。在缺少万古霉素的血平板上，随着传代次数增加，VDEfm-1501的万古依赖性逐渐减弱；传至第3代时菌落主要围绕万古霉素和替考拉宁纸片周围生长，在远离纸片处只有稀疏的菌落；传至第4代时仍然可以看出万古霉素纸片周围菌落密度高于远离纸片的部位，第5代时这种特性不再明显，第6代时这种特性几乎完全失去，在缺少万古霉素的条件下VDEfm-1501可以正常生长。VDEfm-1501正常生长至少需要1.0 μg/mL的万古霉素。

2.3 VDEfm-1501的耐药性及其耐药基因 VDEfm-1501除了对糖肽类抗生素万古霉素和替考拉宁耐药外，同时对多种抗生素(包括青霉素类的氨苄青霉素、氨基糖苷类的庆大霉素以及第三代喹诺酮类的环丙沙星)耐药，仅对利奈唑胺和四环素敏感。VDEfm-1501属于vanA型VRE，同时携带耐药基因ace(6′)-Ie-aph(2″)-la基因(见图1)。

注：aph即ace(6′)-Ie-aph(2″)-la基因

图1 VDEfm-1501耐药基因PCR产物电泳图

2.4 VDEfm-1501分型 VDEfm-1501的7个管家基因atpA、ddl、gdh、purk、gyd、pstS、adk基因的等位基因号分别为15、1、1、1、1、1、1，ST型为ST78，是VRE常见的ST型，属于CC17克隆复合体。

2.5 VDEfm-1501的ddl基因突变情况 与Enterococcus faecium DO参考基因组相比，VDEfm-1501的ddl基因在942 bps处有一个“GG”插入，“GG”的插入导致ddl蛋白在C端发生了一个16个氨基酸移码和28个氨基酸缺失的突变(见图2)。

图2 VDEfm-1501 的ddl基因突变(A)和预测ddl蛋白的结构(B)

3 讨论

由于VRE的泛耐药性、缺少有效药物以及复杂的耐药机制，造成治疗手段非常有限[9]。而VDE的出现给肠球菌感染的诊断和治疗带来了更大的困难和挑战。国内万古霉素、替考拉宁等糖肽类抗生素的使用非常普遍，很容易导致万古霉素敏感型肠球菌(VSE)到VRE及VDE的突变。VDE的发现有两种途径：一是在利用含万古霉素的培养基进行VRE筛查过程中发现[4]；二是在普通血平板(不含万古霉素)中偶然分离到几个稀疏分布、长势很差的疑似肠球菌菌落，在后续的K-B纸片扩散法进行耐药性检测时发现菌落只围绕万古霉素纸片生长，而在普通血平板中继续传代培养非常难，仔细鉴定后确定为VDE[1]。VDEfm-1501的发现过程即属于第二种情况，可能是在患者尿液中残留的万古霉素帮助下，我们才能在原始平板中分离到几个长势较差的菌落，又得益于K-B纸片扩散法才发现其围绕万古霉素纸片生长的特性。但是，在国内很多大型医院的微生物诊断室倾向用MIC法检测细菌耐药性，即使恰巧分离到几个VDE菌落，如果没有相关的知识和相应的技术很容易失去检出VDE的机会。

VDE感染的实验室诊断很明确，在万古霉素存在条件下才能正常生长的营养缺陷型肠球菌即可鉴定为VDE，但在接种、分离、鉴定过程中要注意以下几点：①对血液科、ICU等科室所有送检的细菌培养标本，要常规接种含万古霉素的巧克力平板及进行万古霉素纸片试验；②对近期有万古霉素使用史的患者和应用万古霉素治疗无效的患者的标本，如分离到少量肠球菌，不能主观判断为非致病菌或污染菌而失去检出VDE的机会，因为VDE有时候可能在标本残留的万古霉素作用下少量生长，本研究中的VDEfm-1501在患者尿液中检测到的数量仅为4 000 cfu/mL，远小于有临床意义的105cfu/mL，很容易漏检；③VDE属于较难培养的缺陷型细菌，使用快速生化仪和传统的生化反应鉴定菌种，以及使用纸片法或者MIC法进行耐药性检测时，均要添加万古霉素或者D-alanine-D-alanine[1]，有条件的实验室可以使用质谱法或PCR法进行菌种鉴定。

我们分离的这株VDEfm-1501为ST78，属于常见的CC17克隆复合体，苏州大学附属第一医院中流行的VRE也是这个克隆群，推测VDEfm-1501可能是由VRE突变而来。VDE仍有很强的致病性，且仍保留了范耐药性，不易根除。VDEfm-1501携带胶质黏附素基因(acm基因)和明胶酶基因(gelE基因)两个毒力基因，同时对青霉素类、氨基糖苷类、喹诺酮类等多种抗生素耐药，直接证实了VDE的潜在致病性和泛耐药性。但VDE感染的治疗对策与VRE不同，一旦确诊应立即停止使用万古霉素等糖肽类抗生素[10]。本株VDEfm-1501来源者停用替考拉宁后尿路感染得到控制，其后续标本中未再检出肠球菌。仅停用万古霉素是否合理还需要更多研究证实，因为包括VDEfm-1501在内的VDE很容易突变回VRE，患者有可能是VRE和VDE的混合感染，或者交替感染[11]。对此有学者[12]建议停用万古霉素的同时，还要根据菌种和感染部位适当选用利奈唑胺、达托霉素和奎奴普汀。

万古霉素主要是通过与肽聚糖前体末端的D-alanine-D-alanine结合而抑制肠球菌细胞壁的合成。VRE因为肽聚糖前体的D-alanine-D-alanine被其他形式(如D-alanyl-D-lactate，vanA型VRE)取代，使其与糖肽类抗生素亲和力下降而产生耐药。VSE只能合成正常的末端为D-alanine-D-alanine的肽聚糖，VRE不仅能合成以D-alanyl-D-lactate为末端的替代形式的肽聚糖，也保留了合成正常肽聚糖的能力，因此VRE在有无万古霉素的条件下都可以生长。VDE菌株合成D-丙氨酸连接酶的ddl基因发生了突变，失去了合成正常肽聚糖前体的能力，只能依赖万古霉素诱导形成的另一种连接酶(vanA 或 vanB)合成以D-alanyl-D-lactate为末端的替代形式的肽聚糖。所以从VRE到VDE主要是由于ddl基因突变导致D-alanine-D-alanine 连接酶功能受损[4, 11～13]。VDEfm-1501的ddl基因一个“GG”的插入，引起DDL蛋白的二级结构、螺旋、疏水性、结构域等发生改变，丧失了原有功能，从而导致万古霉素耐药表型的改变，变成VDE。

从VSE到VRE到VDE的发展，无疑是在糖肽类抗生素作用下发生的，但在临床感染病例中，肠球菌是惟一一种呈现依赖抗生素生长特性的细菌，所以要重视VRE和VDE的防控。随着万古霉素等糖肽类抗生素应用越来越多，国内可能会有更多VDE出现，这对肠球菌感染的实验室诊断和治疗提出了挑战。

[1] Fraimow HS， Jungkind DL， Lander DW, et al. Urinary tract infection with an Enterococcus faecalis isolate that requires vancomycin for growth[J]. Ann Intern Med, 1994,121(1):22-26.

[2] Bert F, Leflon-Guibout V, Le Grand J, et al. Emergence of vancomycin-dependent enterococci following glycopeptide therapy: case report and review[J]. Pathol Biol, 2009,57(1):56-60.

[3] Sarma S, Kumar N, Sharma S, et al. Isolation and characterization of the first vancomycin-dependent Enterococcus from India[J]. Indian J Med Microbiol, 2013,31(1)：91-92.

[4] Kerbauy G, Perugini M, Yamauchi L, et al. Vancomycin-dependent Enterococcus faecium vanA: characterization of the first case isolated in a university hospital in Brazil[J]. Braz J Med Biol Res, 2011,44(3):253-257.

[5] 陈险峰,刘耀婷,殷杏,等.3340例ICU患者的病原菌分布及耐药性分析[J].山东医药,2015,55(1):62-64.

[6] Patel SN, Memari N, Shahinas D, et al. Linezolid resistance in Enterococcus faecium isolated in Ontario, Canada[J]. Diagn Microbiol Infect Dis, 2013,77(4):350-353.

[7] Homan WL, Tribe D, Poznanski S, et al. Molecular characterization of resistance, virulence and clonality in vancomycin-resistant Enterococcus faecium and Enterococcus faecalis: a hospital-based study in Beijing, China [J]. Infect Genet Evol, 2015 (33):253-260.

[8] Homan WL, Tribe D, Poznanski S, et al. Multilocus sequence typing scheme for Enterococcus faecium[J]. J Clin Microbiol, 2002,40(6):1963-1971.

[9] 张黎,李军民,万献尧,等.中国人群使用达托霉素治疗革兰阳性菌感染的有效性与安全性[J].中华内科杂志,2015,54(6):496-500.

[10] Hayek L. Vancomycin-dependent enterococcus[J]. Lancet, 1997,349(9049):429-430.

[11] Van Bambeke F, Chauvel M, Reynolds PE, et al. Vancomycin-dependent Enterococcus faecalis clinical isolates and revertant mutants[J]. Antimicrob Agents Chemother, 1999,43(1):41-47.

[12] Tanimoto K, Nomura T, Hamatani H, et al. A vancomycin‐dependent VanA‐type Enterococcus faecalis strain isolated in Japan from chicken imported from China[J]. Lett Appl Microbiol, 2005,41(2):157-162.

[13] Baptista M, Depardieu F, Reynolds P, et al. Mutations leading to increased levels of resistance to glycopeptide antibiotics in VanB‐type enterococci[J]. Mol Microbiol, 1997,25(1):93-105.

Biological characteristics of vancomycin-dependent enterococcus faecium

HANQingzhen1,XUJie,ZHANGXianfeng,QIANXuefeng,ZHANGYang,SHIJinfang,QIUHuiying

(1ClinicalTestingCenter,theFirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,Suzhou215006,China)

Objective To observe the biological characteristics of a vancomycin-dependent enterococcus faecium (VDEfm-1501).Methods A strain of VDEfm-1501 was isolated from an urine specimen of a woman with blood system disease and was identified by VITEK 2, followed by PCR and VITEK MS. The VDEfm-1501 vancomycin-dependent growth characteristics and the minimum vancomycin concentration required for growth were tested by E-test. Its antibiotic resistance was analyzed by K-B disc diffusion. Drug resistance and virulence genes were amplified by PCR. The multilocus sequence typing (MLST) was applied in the sequence typing. Ddl sequencing of VDEfm-1501 was detected by PCR. Results VDEfm-1501 could only grow on the presence of 1.0 μg/mL vancomycin at least, but such characteristic could weaken with the increase of passage times, and no vancomycin-dependence was found in the sixth passage. VDEfm-1501 showed multi-drug resistance except linezolid and tetracycline, and carried resistant gene of ace(6')-Ie-aph(2")-la. VDEfm-1501 belonged to clonal complex 17 (CC17), which was the cause of most of the nosocomial VRE outbreaks globally. And its vancomycin dependence seemed to be associated with the insertion of 'GG' at nucleotide position 942 of the ddl gene.Conclusions The growth of VDEfm-1501 needs at least 1 μg/mL vancomycin, but such dependence is easy to lose. VDEfm-1501 displays multi-drug resistance and carrys the resistant gene of ace(6')-Ie-aph(2")-la. VDEfm-1501 belongs to ST of VRE. The insertion of 'GG' leads to the emergence of VDEfm-1501.

enterococcus; vancomycin-resistant enterococci; vancomycin-dependent enterococci; enterococcus faecium; vancomycin-dependent enterococcus faecium; vancomycin; teicoplanin

国家自然科学基金青年科学基金资助项目(81501425)；江苏省苏州市“科教兴卫”青年科技项目(kjxw2014008)。

韩清珍(1984-)，女，助理研究员，主管检验师，主要研究方向为感染性疾病的实验室诊断。E-mail: gyhqz02@163.com

简介：仇惠英(1966-)，女，主任医师，主要研究方向为血液病的诊治及血液病患者感染的防治。E-mail: qiuhuiying@aliyun.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.43.008

R446.5

A

1002-266X(2016)43-0026-04

2016-07-06)