薛智权，王向英，李 宏，吕建华

（山西农业大学生命科学学院，山西太谷030801）

高效降酚真菌的分离、鉴定及特性研究

薛智权，王向英，李 宏，吕建华

（山西农业大学生命科学学院，山西太谷030801）

苯酚和酚类化合物是环境中常见的有毒污染物。利用富集、筛选和纯化的方法，从山西省太谷县圣源污水处理厂曝气池中分离得到一株能以苯酚为唯一碳源生长的苯酚降解真菌GY8。采用rDNA ITS区序列分析，鉴定该菌株为热带假丝酵母属。该菌株在48 h内对1.0 g/L苯酚降解率接近100%，在以苯酚为唯一碳源的培养条件下能够耐受1.8 g/L的苯酚。同时，通过设定不同pH值、不同接种量、不同溶解氧条件，对该菌降解特性进行研究。结果表明，该菌最适pH值为6.5，随着接种量的增加降解能力增强，5%接种量可使1.0 g/L苯酚在24 h内降解率达90%以上，有氧条件更利于苯酚的降解。研究表明，热带假丝酵母GY8对处理含酚废水具有良好的应用前景。

苯酚和酚类化合物；生物降解；废水处理

环境污染是当今文明社会面临的主要挑战之一。苯酚及其同源物是最常见的有机污染物之一[1]。环境中的苯酚来源于自然和工业。天然酚主要来源于森林火灾，城区或郊区被用作粘合剂的沥青及自然衰变的木质纤维材料等的自然流失物。而炼油厂、化工、石化、制药、冶金、农药产品、油漆和纺织品等行业是酚醛树脂、双酚A、烷基酚等工业酚的主要来源[2-3]。

苯酚的毒性已被广泛记载，它们对人类和环境的灾难性影响已备受关注。几乎所有的酚类化合物对大多数微生物、植物、鱼类和动物都具有高毒性[4]，即使在5～25 mg/L这种相对较低浓度的苯酚对于鱼类也是致命的[5]。酚类的毒性作用包括细胞膜和细胞质凝结透化作用，急性酚暴露可导致眼睛和呼吸道的严重发炎，并可通过摄入或经皮肤吸收而致命，据报道摄取1 g苯酚可致人类死亡[6-7]。慢性酚暴露可导致身体主要器官受损，包括脾脏、胰腺和肾脏[5]。同时，苯酚还是潜在的人类致癌物。目前，苯酚及其衍生物已被美国环保局列入优先有机污染物名单中[8]，并规定在自然水体和土地或市政排污系统中，最大苯酚允许浓度是0.5 mg/L[9]。因此，含苯酚废水排放前必须进行适当的处理。

许多技术已经被用于除去和降解废水中的酚类化合物。这些技术包括吸附、溶剂萃取、活性碳吸附、化学氧化及生物降解[10-13]。但是这些常规的物理化学处理法因高成本和容易形成二次污染而饱受诟病[4]。目前，生物降解是经济且环境友好的方法[14]。因此，苯酚的生物处理已经成为污染防治的首选方法[3，15-17]。

本研究从太谷圣源污水处理厂曝气池中筛选、驯化高效苯酚降解真菌，并对其进行分子鉴定及降解特性的初步研究，从而为含酚废水的治理提供重要的理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

样品采自太谷圣源污水处理厂曝气池中的废水。

富集培养基：蛋白胨10 g/L，马铃薯粉5 g/L，葡萄糖15 g/L，NaCl 5 g/L，氯霉素0.025 g/L。

纯化培养基：K2HPO40.4 g/L，KH2PO40.2 g/L，NaCl 0.1 g/L，MgSO40.1 g/L，MnSO4·H2O 0.01 g/L，Na2MoO4·2H2O 0.01 g/L，（NH4）2SO40.4 g/L，加水定容，高压蒸汽灭菌（121℃，灭菌20 min），冷却后加入氯霉素0.025 g/L，苯酚质量浓度1.0 g/L。

筛选培养基：K2HPO40.4 g/L，KH2PO40.2 g/L，NaCl 0.1 g/L，MgSO40.1 g/L，MnSO4·H2O 0.01 g/L，Na2MoO4·2H2O 0.01 g/L，（NH4）2SO40.4 g/L，琼脂粉15 g/L，加水定容后，高压蒸汽灭菌（121℃，灭菌20 min），冷却后加入氯霉素0.025 g/L，苯酚根据需要量加入。

1.2 降解苯酚真菌的分离筛选

配制100 mL的富集培养基，高压灭菌后加入终浓度0.025 g/L的氯霉素溶液和终浓度1 g/L苯酚溶液混匀，取5 mL太谷县圣源污水处理厂曝气池废水接种到培养基中，置于28℃，150 r/min的摇床上振荡培养2 d。将富集液稀释10-4～10-6倍，然后分别取200 μL接种到苯酚质量浓度分别为1.0，1.5，2.0 g/L的筛选培养基上，置于28℃恒温培养箱中培养5 d，挑取在最高苯酚浓度的筛选培养基上生长的菌落，接种于富集培养基中，于28℃，150 r/min的摇床上振荡培养2 d。

1.3 降解苯酚真菌的纯化

配制纯化培养基，灭菌后加入苯酚溶液，混匀，使培养基的苯酚浓度为1.0 g/L，将分离筛选的菌落富集培养液，按照4%的接种量接种到纯化培养基中，并且按照同样的方法，用水代替菌液水做阴性对照，置于28℃，150 r/min的摇床上培养48 h。然后用4-氨基安替比林分光光度法测定苯酚浓度，计算苯酚降解率。苯酚降解率＝（未接菌前培养液苯酚量-培养结束培养液残余苯酚量）/未接菌前培养液苯酚量×100%。筛选出苯酚降解能力高的菌株用于后续试验。

1.4 不同浓度苯酚对菌株生长影响

将纯化的菌株接种到苯酚质量浓度分别为1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2.0 g/L的筛选培养基中，置于28℃恒温培养箱中培养5 d，确定菌株耐受的最高苯酚浓度。

1.5 高效降解苯酚真菌的鉴定

取1 mL菌落的富集培养液，8 000 r/min，离心10 min，倒掉上清液，沉淀加100 μL双蒸水混匀。将混悬液煮沸10 min，然后在-20℃冷冻10 min，反复2次。将裂解液置于高速冷冻离心机中，4℃，8 000 r/min，离心10 min，取上清作为PCR模板。真菌ITS引物序列为：上游引物ITS4：5′-TCCTCCGCT TATTGATATGC-3′；下游引物ITS5：5′-GGAAGTA AAAGTCGTAACAAGG-3′。PCR扩增产物由北京华大基因有限公司进行测序。然后，通过BLAST与NCBI数据库序列进行比对，并通过MEGA5.0软件构建系统进化树。

1.6 菌株降解苯酚条件优化

在无机盐液体培养基中，加入1 g/L苯酚，分别检测不同pH值、接种量以及装液量对GY8菌株降解苯酚以及菌株生长的影响。

2 结果与分析

2.1 降解苯酚真菌的筛选和鉴定

经过富集培养、分离纯化后，从苯酚质量浓度为1.5 g/L的纯化培养基上挑选15株生长较好且形态各异的菌株，分别编号GY1～GY15，将15株菌接种到筛选培养基后，获得1株能在含有1.8 g/L苯酚的无机盐固体培养基中生长的真菌菌株，命名为GY8。利用真菌rDNAITS通用引物进行PCR扩增，得到长度约为522 bp的扩增产物，序列（accession number KU974147）经BLAST与NCBI数据库中登录的序列比对分析，结果表明，它与热带假丝酵母EF196807.1序列有99%的相似性（图1），鉴定该菌株为热带假丝酵母（Candida tropicalis）。

2.2 不同pH值对GY8菌株降解性能的影响

pH值在生物降解中发挥着重要的作用[18-20]，本研究分别设定初始pH值为5.5，6.5，7.5，8.5，9.5，以1 g/L苯酚为唯一碳源的无机盐液体培养基，按4%接种量，培养温度28℃，180 r/min，培养20 h。从图2可以看出，该菌株只有在pH值5.5～7.5时苯酚发生降解，pH值为8.5～9.5时几乎不降解，且在pH值为6.5（无机盐自然pH值）时降解能力最强。故该菌为偏酸性菌，碱性环境几乎无降解作用，最适pH值为6.5。

2.3 不同接种量对GY8菌株降解性能的影响

将富集培养菌液按照5%，9%，13%，17%的接种量接种于以1 g/L苯酚为唯一碳源的无机盐液体培养基，培养温度28℃，180 r/min，pH值自然条件下振荡培养。培养48 h后，不同接种量对菌株降解苯酚的影响如图3所示，培养72h后苯酚全部降解。

从图3可以看出，在最低接种量为5%时，48 h菌株对苯酚降解率为93%。接种量在13%和17%时，48 h全部降解。说明菌株对苯酚的降解率随着接种量的增加而增大，5%接种量在72 h内可以充分降解苯酚质量浓度为1 g/L的培养液。

2.4 不同装液量对GY8菌株降解性能的影响

在苯酚质量浓度1 g/L，菌悬液按5%接种量接种于液体培养基装液量分别为16%，24%，32%，40%的250 mL三角瓶中。28℃，180 r/min振荡培养。培养48 h后，苯酚降解率随着装液量的增加而降低（图4），培养72 h后苯酚全部降解。而装液量越多溶解氧越低，从而说明该菌在有氧的条件下利于苯酚降解。

2.5 最大耐受苯酚浓度的确定

将GY8菌株分别接种于以1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2.0 g/L苯酚为唯一碳源的无机盐固体培养基上，28℃恒温培养箱培养72 h，观察菌落生长情况。结果表明，在恒温箱培养72 h后，该菌株在苯酚质量浓度为1.8 g/L及以下质量浓度的无机盐固体培养基上均有菌落生长，而1.9，2.0 g/L均无菌落生长。说明该菌株最大耐受苯酚质量浓度为1.8 g/L。

3 结论

本研究采用富集、纯化和筛选的方法，从山西省太谷县圣源污水处理厂筛选到一株高效苯酚降解菌。经分子鉴定为热带假丝酵母菌，命名为GY8。该菌在pH值5.5～7.5的范围内均可降解苯酚，在pH值6.5降解率最大；接种量为5%，苯酚质量浓度为1 g/L时，48 h苯酚降解率为93%，72 h内苯酚全部降解；有氧条件下利于苯酚的降解；该菌能耐受最大苯酚质量浓度为1.8 g/L。结果表明，GY8对于含酚废水的处理具有潜在的应用价值。

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Study on Isolation，Identification and Characteristic of Phenol Degradation Fungus

XUE Zhiquan，WANGXiangying，LI Hong，LÜ Jianhua
（College ofLife Sciences，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

Phenol and phenolic compounds are one ofthe most prevalent toxic environmental pollutants.In this paper,by using the enrichment,selection and pure culture,a phenol-biodegrading fungus strain,designated as GY8,was isolated from the aeration tank of Taigu wastewater treatment plant.The strain was able to utilize phenol as a sole carbon source.Analysis of the rDNA ITS sequence showed that it belonged to the genus of Candida tropicalis.The strain could degrade almost 1.0 g/L of phenol within 48 h and could tolerate up to 1.8 g/L phenol by utilizing it as the sole carbon source.Various parameters were investigated for the maximum biodegradation of phenol by setting different levels of pH,inoculum size,and dissolved oxygen conditions.The results showed that the maximum growth and phenol degradation of strain could be obtained under the optimal condition of pH 6.5.Increasing inoculum size could accelerate the degradation rate.The rate ofphenol degradation at concentration of1.0 g/Lreached above 90%at 5%（v/v）inoculum size within 24 h.The dissolved oxygen could accelerate the rate of phenol degradation.It is concluded that the organism i.e.Candida tropicalis GY8 has potential prospect in bio-treatment ofphenol-containingwastewater.

phenol and phenolic compounds;biodegradation;wastewater treatment

Q93

A

1002-2481（2016）06-0801-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.06.20

2016-04-22

山西农业大学科技创新基金项目（20132-09）；山西农业大学161博士科研启动费科技项目（J141602001）

薛智权（1976-），男，四川仪陇人，讲师，博士后，主要从事环境微生物研究工作。吕建华为通信作者。