■杨佳蕾 张学雯 李术娜*

（1.西北农林科技大学经济管理学院，陕西杨凌 712100；2.河北农业大学生命科学学院，河北保定 071001)

我国的畜禽主要食用玉米-豆粕型日粮，这种饲料富含半纤维素。木聚糖是半纤维素的一种主要组成部分，占植物干重的35%，是自然界中第二丰富的物质资源[1-3]。研究表明畜禽食用木聚糖后使消化道内容物具有较强的黏性，导致畜禽消化道功能减弱，影响畜禽的生长性能与饲料利用率。动物自身分泌的酶不能将摄入的木聚糖完全消化，畜禽会出现营养物质利用率降低，生长性能下降等现象。

大量研究证实，饲粮中辅加相应酶制剂，能够提高动物对饲料的利用率，进而提高动物生长性能。谭权等[4]在日粮中添加木聚糖酶，发现其可促进肉鸡生长性能；李建民等[5]在日粮中添加混合饲用酶制剂，结果表明可促进肉兔生长性能；胡向东等[6]在饲粮中添加木聚糖酶，证实可促进生长猪生长性能；张仁祥等[7]在日粮中添加复合酶，证实可促进泰山肉兔增重。但此法成本较高，因此有学者[8-9]尝试在日粮中直接添加益生菌、产酶菌的方式来促进动物的健康节粮养殖，这种方法对菌剂提出了更高的要求：菌株不仅具有明确的产酶能力，还要易于生产，最重要的是要耐受动物胃肠道的极端环境。目前已报道的木聚糖菌株中[10-11]，学者们多注重对酶活力与酶性质的研究，缺少对耐受动物胃肠道能力、生产能力及安全性的考察。

本研究通过筛选耐受动物胃肠道环境的产木聚糖酶的芽孢杆菌，并对菌株进行菌种鉴定与安全性试验，为饲用产酶菌剂的研制开发积累菌种资源，奠定科学基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌源样品

用对角线法采集保定市南市区牛粪便以及长期堆放腐败秸秆、树叶的10～15 cm深处土壤，大约各取50～100 g保存在采样袋中，分别编号并记录采集地点和时间。

1.1.2 培养基

1.1.2.1 菌株筛选培养基

NB培养基：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10 g，氯化钠5.0 g，加水至1 000 ml，pH值7.2～7.4。

NA培养基：为NB培养基加入2%的琼脂。

产木聚糖酶富集培养基：玉米芯木聚糖10.0 g，氯化钠5.0 g，蛋白胨3.0 g，硝酸铵2.0 g，磷酸氢二钾 2.0 g，七水合硫酸镁 0.2 g，蒸馏水 1 000 ml，pH值自然。

产木聚糖酶分离培养基：琼脂20.0 g，玉米芯木聚糖10.0 g，硝酸钾1.0 g，磷酸氢二钾0.5 g，氯化钠0.5 g，七水合硫酸镁0.2 g，蒸馏水1 000 ml，pH值自然。

1.1.2.2 菌株生理生化试验培养基

参照《常见细菌系统鉴定手册》配制。

1.1.3 试剂

菌种鉴定试剂：根据《常见细菌系统鉴定手册》配制，包括本尼迪克特氏试剂、格里斯氏试剂、Kovac's试剂、甲基红试剂、V-P测定试剂等。

人工胃液、人工肠液参照Galindo A B方法配制[12]。

胆酸盐溶液配制：在100 mlNB培养基中加入胆酸盐，配成浓度分别为0.5%、0.3%、0.1%的溶液，115℃灭菌30 min。

1.1.4 试验动物

试验小鼠：购买60只健康小白鼠，体重为(20±2)g，购回后进行3 d预饲养，然后分组进行试验。房间温度为（20±1）℃，相对湿度为50%。

肉兔：河北农业大学标本园养殖基地购买的60日龄肉兔60只，随机分为6组，每组10只，不分公母。采用笼内饲养。

肉兔饲料：河北省禽塔集团购买。

配方见表1。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

1.1.5 试验菌粉

由河北民得富生物科技有限公司进行液体发酵，喷雾干燥，制成菌粉，最终制得含生物量为1.5×1011cfu/g的试验菌粉。

1.2 产木聚糖酶芽孢杆菌的分离筛选

1.2.1 产木聚糖酶芽孢杆菌的富集培养与分离

将菌源样品5.00 g放入含100 ml无菌水的三角瓶中，充分摇匀使成菌悬液，置80℃水浴20 min。进行稀释涂布，培养到长出菌落，挑取形态不同的单菌落编号保藏于NA培养基斜面上。

1.2.2 产木聚糖酶芽孢细菌的筛选

分别挑取初筛菌株点种在产木聚糖酶分离培养基平板上，然后37℃培养48 h，用1.0%刚果红溶液覆盖培养基平板表面30 min，培养基表面用饱和氯化钠溶液冲洗，观察是否存在透明圈，将产生透明圈的菌株进行菌种保藏，并编号。

将初筛菌株接种于NB培养基中，摇床培养12 h，接种于发酵培养基中，同样条件培养24 h，取发酵液10 000 r/min离心5 min，取上清液测定木聚糖酶活力，选用GB/T23874—2009饲料添加剂木聚糖酶活力方法测定。

1.3 菌株的种属鉴定

1.3.1 形态观察

从NA培养基斜面上挑取菌株于NB培养基中，摇床培养24 h，稀释涂布，倒置培养24 h后观察菌落形态。挑取单菌落进行制片，革兰氏染色后观察单菌体形态。

1.3.2 生理生化试验

参照《伯杰细菌鉴定手册》第八版[13]和《常见细菌系统鉴定手册》[14]，对细菌进行生理生化鉴定。

1.3.3 菌株DNA提取和16S rDNA序列分析及系统发育树绘制

参考李云程等[15]方法进行菌株DNA提取和16S rDNA序列分析及系统发育树绘制。

1.4 产木聚糖酶芽孢杆菌菌株安全性、胃肠道环境耐受性试验

菌株A-5种子液的制备：从活化好的菌株A-5斜面挑取少量菌苔于NB培养基中，37℃、200 r/min摇床培养24 h，在超净台中用无菌水稀释成浓度为1.0×108cfu/ml的种子液。

菌株的安全性试验：根据GB159193.3—2003窛氏（KORBOR）法对菌株A-5进行毒性、一般体征和脏器安全性检测。试验小鼠灌入剂量分别为0.5、1.0 g/kg和5.0 g/kg体重，连续喂养14 d。试验开始后每天观察小鼠精神状态、是否有中毒症状、生长及排便状况。在小鼠断颈处死前12 h对小鼠进行禁食，然后称量各组小鼠重量，并对脏器进行观察和称重。

菌株人工胃液耐受性：将接种量1%菌株A-5种子液接入到人工胃液中，摇床培养并进行活菌计数。

菌株耐胆酸盐试验：将菌株A-5种子液按1%的接种量接种至胆盐浓度分别为0.5%、0.3%、0.1%的NB培养基于37℃、200 r/min培养24 h后，进行活菌计数。

菌株人工肠液耐受性：将接种量1%菌株A～5种子液按1%的接种量接入到人工肠液中，摇床培养并进行活菌计数。

1.5 产木聚糖酶芽孢杆菌制剂的肉兔饲喂效果

1.5.1 肉兔的分组和饲养管理

试验设计成6组。对照组：饲喂全价饲料。试验1～5组在全价饲料的基础上添加A-5菌剂：添加量分别为0.10%、0.25%、0.50%、0.75%、1.00%，即分别配制成活菌体生物量为1.500×108、3.750×108、7.500×108、1.125×109、1.500×109cfu/g的饲料。

饲喂：每天饲喂肉兔3次，保持水槽内水量充足。预试期2 d，正试期28 d。

1.5.2 试兔生长性能测定

试验前后对肉兔分别称重，记录给料量。计算肉兔平均日采食量（ADFI）、平均日增重（ADG）和料重比（F/G）。

平均日采食量[g/(d·只)]=(给料量-剩料量)/(天数·只数)；

平均日增重[g/(d·只)]=(试验后体重-试验初体重)/(天数·只数)；

料重比=采食量/增重。

1.6 数据统计分析

利用SPSS 19.0统计软件对生长指标的数据进行统计学分析，P＜0.05，表示差异显著。

2 结果

2.1 产木聚糖酶芽孢杆菌的筛选

在筛到的芽孢杆菌中用刚果红法进行初筛，得到有透明圈菌株的48株（见图1）。筛到的菌株大多数符合细菌的菌株形态。

图1 菌株刚果红初筛照片

将在产木聚糖酶发酵培养基中酶活力较高的14株菌株重新编号(见表2)，其中菌株A-5酶活力最高，达到56.848 U/ml。

表2 木聚糖酶活力测定结果

2.2 菌株的种属鉴定

2.2.1 菌株的形态观察

图2 菌株A-5的单菌落及菌体形态

由图2可见，菌株A-5表面呈乳白色，光滑，边缘呈锯齿状，菌体成杆状，革兰氏染色反应呈阳性，大小为5.1×0.9 μm。

2.2.2 菌株的生理生化试验

参照《伯杰细菌鉴定手册》第八版和《常见细菌系统鉴定手册》，对细菌进行了生理生化鉴定。主要进行蔗糖发酵、V-P试验、甲基红、乳糖发酵、明胶液化等20多项试验。以Bacillus subtilis标准菌株36K（登陆号EF433406）作为对照，见表3。2.2.3 菌株的16S rDNA序列分析和系统发育树的构建

表3 菌株A-5生理生化试验结果

将菌株A-5的16S rDNA序列结果放在GenBank上进行序列比对，构建了系统发育树（见图3）。

图3 菌株A-5的系统发育树

经过序列比对，供试菌株A-5应属于芽孢杆菌属。另外，供试菌株A-5与Bacillus subtilis36K的标准菌株16S rDNA序列的同源相似性高达99.95%，因此鉴定此菌株为Bacillus subtilis。

2.3 产木聚糖酶芽孢杆菌菌株安全性、胃肠道环境耐受性试验

2.3.1 菌株安全性试验

小鼠摄入含菌株A-5的菌粉后呼吸平稳，没有出现中毒症状，更无死亡现象，无异常表现，生长状况良好。经过称重，对照组和空白组体重相近。

2.3.2 菌株人工胃液耐受性情况

菌株A-5在pH值为3.0的人工胃液中0、1、2 h后平均存活率分别为100%、95.66%、90.13%，在pH值为2.0的人工胃液中0、1、2 h后平均存活率分别为100%、97.58%、92.07%。

2.3.3 菌株耐胆酸盐试验情况

菌株A-5在浓度分别为0.1%、0.3%、0.5%胆盐溶液中，平均存活率分别为91.75%、16.55%、5.00%。

2.3.4 菌株人工肠液耐受性情况

菌株A-5在人工肠液中0、1、2 h后平均存活率分别为100%、92.35%、88.45%。

2.4 产木聚糖酶芽孢制剂的肉兔饲喂效果（见表4）

由表4可知，各试验组平均日增重较对照组都有提高，料重比较对照组均有降低，试验1～5组日均增重较对照组分别提高 5.57%（P＜0.01）、7.92%（P＜0.01）、5.48%（P＜0.01）、4.74%（P＜0.05）和 2.48%（P＞0.05），料重比较对照组分别降低了5.23%（P＜0.01）、6.09%（P＜0.01）、4.38%（P＜0.05）、4.03%（P＜0.05）和2.01%（P＞0.05）。菌剂添加量太少，产酶量过低，不能充分酶解饲料中的木聚糖；菌剂添加量太多，会使动物胃本身肠道菌群失衡。所以菌剂添加量太少或太多都不能使试验动物生长性能达到最佳。

表4 试兔生长性能变化统计

3 讨论

由于微生物来源的木聚糖酶是目前工业生产中木聚糖酶的主要来源。而微生物来源的木聚糖酶其产生菌则以芽孢杆菌属菌株为主。前人已有对木聚糖酶生产菌株的报道，如罗玲等[16]获得一株木聚糖酶生产菌株LMZY为异硫链霉菌，酶活力达3.543 U/ml；戚永跃等[17]得到一株产木聚糖酶菌株50647，鉴定其属于拟盘多毛孢属，木聚糖酶的酶活峰值为49.3 U/ml；钟敏等[18]分离到一株产木聚糖酶的霉菌菌株X-1，木聚糖酶酶活达724.63 U/ml等。本研究获得了产木聚糖酶的野生菌株，酶活力较高。但是在饲料中直接添加木聚糖酶产酶菌剂的研究却未见报道，此法较酶制剂法成本更低。

目前，越来越多的学者关注肠道微生物结构与动物生长与健康的相关性的关系。本试验结果表明，在肉兔日粮中添加比例为0.25%木聚糖酶产酶菌剂可以提高肉兔的平均日增重，促进肉兔生长。分析原因可能是随着菌剂的添加，会改善试兔的肠道菌群构成，同时，菌剂进入兔的肠道环境后定植并产酶，增加了肠道消化酶的活力，双方面的共同作用，致使动物增加了对日粮的消化利用能力，最终达到促进动物生长的目的。

4 结论

本试验筛选得到一株产木聚糖酶的野生菌株A-5，经鉴定为枯草芽孢杆菌，其产酶活力为56.848 U/ml。在肉兔日粮中添加该菌剂对肉兔的生长性能有显著促进作用，研究结果为肉兔饲料的合理利用、肉兔的高效养殖提供了新的思路。