高文宏 林平舟 钟碧疆 曾新安

(华南理工大学 食品科学与工程学院， 广东 广州 510640)

水溶性大豆多糖对啤酒酵母悬浊液的絮凝作用*

高文宏 林平舟 钟碧疆 曾新安

(华南理工大学 食品科学与工程学院， 广东 广州 510640)

采用酒石酸、六偏磷酸钠和氢氧化钠浸提豆渣制得大豆多糖SSPS P1、SSPS P2和SSPS P3，分别考察金属阳离子(Al3+、Fe3+、Fe2+、Mg2+、Ca2+、K+、Na+)、多糖浓度、pH值以及温度对SSPS絮凝啤酒酵母悬浊液的影响，并进行响应面试验设计，优化SSPS P1絮凝酵母悬浊液的条件，得到相应的数学回归模型.单因素研究结果表明：3种水溶性大豆多糖中SSPS P1絮凝酵母悬浊液的效果最好；多数金属离子对于3种SSPS的絮凝性起促进作用，其中Fe3+协同絮凝效果显著，Fe3+浓度在0.025 mmol/L时效果最好；SSPS P1浓度和温度也会影响絮凝啤酒酵母悬浊液的效果，SSPS P1质量浓度和温度分别为10 mg/L和30 ℃时效果较好；强碱性环境有利于SSPS P1絮凝酵母悬浊液.分析数学回归模型得到的絮凝最佳条件为SSPS P1质量浓度11.56 mg/L、Fe3+浓度0.26 mmoL/L、pH值 9.05、温度30.68 ℃，絮凝率的预测值与实验值非常接近，回归模型能够反映各因素对啤酒酵母悬浊液絮凝效果的影响.

水溶性大豆多糖；絮凝；啤酒酵母悬浊液；金属阳离子；响应面法

在啤酒生产过程中，啤酒酵母是啤酒酿造的灵魂，对啤酒质量起决定性作用[1- 2].经过主发酵和后发酵的酿造工艺之后，会产生大量废啤酒酵母.啤酒酵母属于真菌类，含有大量丰富的蛋白质、核酸、维生素和矿物质，对于废酵母的利用多数是经过简单加工制成粗蛋白饲料进入畜牧养殖行业，更有甚者将其直接排入到江河中，不仅造成了资源的极大浪费还引起环境污染等一系列的问题.

絮凝是污水处理以及食品工业中的一道重要工序，通过向液体中添加絮凝剂使液体中悬浮微粒集聚或形成絮团从而加快粒子的聚沉，达到澄清污水或者食品料液的目的.传统的无机絮凝剂存在投放量大、效率低甚至对人体有害的缺陷；合成絮凝剂由于其价格高、毒性大的缺点，应用也颇受限制；天然有机高分子絮凝剂原料来源丰富、价格低廉、可完全生物降解，此领域的开发受到了人们很大的关注.水溶性大豆多糖(SSPS)是一种水溶性多糖类物质[3]，其含有18%半乳糖醛酸的酸性多糖，相对分子质量为5 000～1 000 000，主链由鼠李半乳糖醛酸和高聚半乳糖酸组成，侧链由半乳聚糖和阿拉伯糖结合组成，整体结构与果胶类似[4- 10].已有的研究表明大豆多糖对于高岭土悬浊液有很好的絮凝效果[11]，水溶性大豆多糖提取自豆渣中，无任何毒性.将水溶性大豆多糖或其改性产物用作高效絮凝剂使用，不仅可以提高水处理效率，而且对于回收絮凝物意义重大.文中采用3种不同方法提取水溶性大豆多糖，絮凝酵母，以期达到回收利用啤酒酵母、减少环境污染、高效利用豆渣及废啤酒酵母这两种食品工业废弃资源的目的，从而提高啤酒工业的经济效益和社会效益.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

主要材料：豆渣，购自广州市番禺区金伯乐调味品有限公司；啤酒酵母IF 02044，广东省微生物研究所研制；六偏磷酸钠、氢氧化钠、酒石酸、乙醇、丙酮均为分析纯，广州化学试剂厂生产.

主要仪器：分析天平，梅特勒-托利多仪器有限公司生产；TU-1901双光束分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司生产；PHSJ-4A型实验室pH计，上海精密科学仪器有限公司生产；XW-80A微型漩涡混合仪，上海泸西分析仪器厂有限公司生产.

1.2 实验方法

1.2.1 水溶性大豆多糖的制备

实验步骤[12- 15]：称取豆渣，按表1的浸提条件加入溶剂浸提、过滤，再将残渣反复提取3到4次后，对滤液进行浓缩、醇沉和离心，随后分别用85%(体积分数)乙醇、无水乙醇和丙酮洗涤固形物，最后将其置于烘箱中干燥至恒重.

表1 水溶性大豆多糖浸提条件

1)豆渣质量(g)和蒸馏水体积(mL)之比.

1.2.2 啤酒酵母悬浊液的制备

培养基配制：将0.5%蛋白胨、0.3%酵母提取物、0.3%麦芽提取物和1.0%葡萄糖溶解后调节pH值至6.0.

啤酒酵母需氧摇床培养条件：培养时间为12 h、温度28 ℃.

悬浊液的配制：将培养好的酵母在10 000 r/min下离心5 min，得到酵母沉淀，蒸馏水配制吸光值为1.400±0.005的酵母液作为絮凝悬浊液对象.

1.2.3 絮凝实验方法

取酵母悬浊液9.3 mL，加入指定浓度絮凝剂溶液0.2 mL和指定浓度金属阳离子溶液0.5 mL，混匀后采用微型旋涡仪震荡1 min后静置10 min，取上清液1 mL，稀释，在550 nm下测定吸光值.将絮凝剂及助凝剂替换为蒸馏水做空白对照，其他操作不变，测定吸光值，按照式(1)计算絮凝率：

η=(A0-A1)/A0×100%

(1)

式中：A1为加入大豆多糖絮凝剂及盐类助凝剂的吸光值；A0为空白组的吸光值；η为絮凝率.

依照此方法，将SSPS P1、SSPS P2、SSPS P3配成质量浓度为2 mg/L的溶液进行絮凝实验，初步探讨3种SSPS的絮凝活性.絮凝条件为30 ℃、pH=6.0.1.2.4 响应面中心组合实验

选取SSPS P1质量浓度(ρ(SSPS P1))、Fe3+浓度(c(Fe3+))、pH值、温度(θ) 4因素进行中心组合实验.采用Design-Expert分析各因素对酵母悬浊液絮凝率的影响.

2 结果与分析

2.1 3种SSPS对啤酒酵母悬浊液的絮凝作用

如图 1所示，在不添加任何金属阳离子的条件下，3种SSPS对于啤酒酵母的絮凝效果不佳，絮凝率均比较低，其中SSPS P1效果最好，SSPS P2次之，SSPS P3几乎不具有絮凝性.显著性分析表明：SSPS P1的絮凝率显著高于其余两种大豆多糖.而在大豆多糖对高岭土的絮凝效果中，不添加任何金属离子条件下，SSPS P2絮凝率可以达到6.27%，SSPS P3也达到2.05%，SSPS P1几乎不具絮凝效果[11]，这说明大豆多糖对于高岭土和啤酒酵母的絮凝效果有显著的不同.

图1 3种SSPS对啤酒酵母悬浊液的絮凝效果比较

Fig.1 Comparison of flocculating property between three SSPSs in brewer yeast suspension

不同字母表示显著性差异

2.2 金属阳离子协同SSPS对酵母悬浊液絮凝的影响

2.2.1 金属阳离子种类对3种SSPS絮凝活性的影响

依照1.2.3节的方法，絮凝条件定为30 ℃、金属阳离子浓度为0.25 mmol/L、SSPS质量浓度ρ(SSPS)为10 mg/L，pH=6.0，分别测定Al3+、Fe3+、Fe2+、Mg2+、Ca2+、K+、Na+存在下酵母悬浊液的絮凝率，结果如图2所示.由图可以看出，多数金属离子对3种SSPS的絮凝性起促进作用.其中，Fe3+配合SSPS P1以及SSPS P2的促进作用最好，絮凝率达到了60%左右；除此之外，Al3+对于SSPS P2也有很好的促进效果，絮凝率接近20%；其他金属阳离子对于3种SSPS的絮凝性促进作用均不大，絮凝率在10%左右或者更低的水平.需要指出的是,Ca2+、Fe2+以及Mg2+配合SSPS P3对絮凝性均无促进作用.

图2 金属阳离子种类对SSPS絮凝啤酒酵母悬浊液的影响

Fig.2 Effects of metal cation types on flocculating property of SSPSs in brewer yeast suspension

2.2.2 Fe3+浓度对SSPS P1以及SSPS P2絮凝活性的影响

固定絮凝条件为30 ℃、ρ(SSPS)为10 mg/L、pH=6.0，分别测定c(Fe3+)为0.05、0.15、0.25、0.35、0.45 mmol/L下酵母悬浊液的絮凝率，Fe3+浓度对SSPS P1及SSPS P2絮凝活性的影响如图3所示.从图中可看出，Fe3+浓度小于0.25 mmol/L时，SSPS P1及SSPS P2絮凝率均随Fe3+浓度的增加而增加，Fe3+浓度为0.25 mmol/L时，SSPS P1和SSPS P2絮凝率分别达到最大值64.8%和59.1%.当Fe3+的浓度大于0.25 mmol/L时，由于过量铁离子无法与大豆多糖形成架桥发挥絮凝作用，二者絮凝率随金属离子浓度的增加而减少.从图中也可看出，Fe3+和SSPS P1协同絮凝效果优于和SSPS P2的，由此选定SSPS P1进行后续实验.

图3 Fe3+浓度对SSPS P1及SSPS P2絮凝活性的影响

Fig.3 Effects of Fe3+concentrations on flocculating activity of SSPS P1and SSPS P2

2.3 SSPS P1质量浓度对絮凝啤酒酵母悬浊液的影响

由2.2节的结论，考察ρ(SSPS P1)分别为0、5、10、15、20 mg/L时，SSPS P1对啤酒酵母絮凝率变化的影响，絮凝条件为30 ℃、c(Fe3+)为0.25 mmol/L、pH=6.0,结果见图4.随着SSPS P1质量浓度增加絮凝率先增加后减小，SSPS P1质量浓度为10 mg/L时絮凝率取得最大值.

图4 SSPS P1质量浓度对含Fe3+啤酒酵母悬浊液絮凝性的影响

Fig.4 Effects of SSPS P1mass concentrations on flocculating brewer yeast suspension containing Fe3+

2.4 pH值对SSPS P1絮凝啤酒酵母悬浊液的影响

依照1.2.3节的方法，固定絮凝条件30 ℃、c(Fe3+)为0.25 mmol/L、ρ(SSPS P1)为10 mg/L，分别测定pH值为1、3、5、7、9、11、12时酵母悬浊液的絮凝率.不同pH值对絮凝率的影响结果如图 5所示.由图可知，随着pH值的增加，SSPS P1的絮凝性逐步增加，当达到强碱性条件(pH≥11)时，絮凝率接近100%.这说明碱性条件有利于SSPS P1对啤酒酵母悬浊液的絮凝.但强碱性会导致蛋白变性，可能会对啤酒酵母的回收利用产生不利影响.

图5 pH值对SSPS P1絮凝啤酒酵母悬浊液的影响

Fig.5 Effects of pH values on flocculating brewer yeast suspension with SSPS P1

2.5 温度对SSPS P1絮凝啤酒酵母悬浊液的影响

絮凝条件为：c(Fe3+)为0.25 mmol/L、ρ(SSPS P1)为10 mg/L、pH=6.0,分别测定温度在15～50 ℃范围内的絮凝率，结果如图6所示.由图可知：随着温度升高絮凝率增加，当温度达到30 ℃时，絮凝率达最大值68.89%，温度继续升高，絮凝率下降.这说明温度过高或过低都不利于SSPS P1对啤酒酵母悬浊液的絮凝，在最优的絮凝温度下，絮凝率最高.

图6 温度对SSPS P1絮凝啤酒酵母悬浊液的影响

Fig.6 Effect of temperature on flocculating brewer yeast suspension with SSPS P1

2.6 SSPS P1絮凝酵母悬浊液条件的响应面优化

在单因素试验的基础上，根据中心组合设计(CCD)原理，以SSPS P1质量浓度、Fe3+浓度、絮凝温度、体系pH值 4个因素为自变量(以A、B、C、D表示)，以絮凝率为响应值，设计了四因素五水平试验，探索SSPS P1絮凝啤酒酵母的最优条件.表 2为响应面中心组合设计的因素和水平，试验设计与结果见表3.

表2 响应面中心组合设计的因素和水平

Table 2 Factors and levels of response surface central composite design

水平ρ(SSPSP1)/(mg·L-1)c(Fe3+)/(mmol·L-1)pH值θ/℃-250．05620-1100．157250150．208301200．359352250．451040

表3 中心组合试验设计及结果

2.6.1 模型的建立与显著性分析

利用Design Expert(v8.0724)软件对表 3中所得数据进行二次多项回归拟合，可以获得SSPS P1质量浓度(A)、Fe3+浓度(B)、pH值(C)、温度(D)和絮凝率(Y)之间的二次多项式回归方程为：

Y=58.86-7.93A+2.13B+5.63C+2.95D+

4.33AB-0.29AC+1.50AD+2.36BC+

2.51BD-1.56CD-5.41A2-7.18B2-

2.83C2-2.29D2

(2)

对统计测试模型进行方差分析，絮凝率的二次多项式拟合模型的方差分析和回归方程系数见表4.可知，回归方程失拟检验不显著(P=0.067 2)，这说明未知因素对于试验结果的干扰非常小，拟合检验极显著(P<0.000 1)，方程一次项中SSPS P1质量浓度、pH值的影响极其显著，温度对絮凝效果影响显著，交互项AB的影响显著，二次项A2、B2的影响达到了极显著的水平，C2、D2的影响达到了显著水平，说明4个因素对絮凝率的影响均有二次关系.该模型的复相关系数R2=0.926 2，说明该模型与实验值拟合很好，较好地反映了絮凝率与SSPS P1质量浓度、Fe3+浓度、pH值以及絮凝温度的关系，因此所得回归方程可以较好地预测SSPS P1絮凝啤酒酵母过程中，絮凝率受各种因素影响的变化规律.

表4 响应面二次模型方差分析1)Table 4 Analysis of variance for response surface quadratic mode

1)复相关系数(R2)为0.926 2；校正复相关系数为0.853 4；预测复相关系数为0.600 6；信噪比为10.138.

2.6.2 响应面分析

为考察交互项对啤酒酵母絮凝效果的影响，在其他因素各条件固定不变的情况下，对模型进行降维分析，经Design-Expert软件分析所得到结果见图7.

图7 温度、pH值、SSPS P1质量浓度、Fe3+浓度对啤酒酵母絮凝交互影响的三维曲面图

Fig.7 Response surface plots showing the mutual interactions between temperature,pH values,the mass concentration of SSPS P1and the concentration of Fe3+on flocculation of yeast

从图7中可以看出，随着每个因素的增大，响应值增大；响应值增大到极值后，随着因素的增大，响应值逐渐减小.其中较为明显的是Fe3+浓度、SSPS P1质量浓度、温度.随着pH值的增大絮凝率逐渐增大，这表明相当的范围内碱性环境有利于啤酒酵母的絮凝，这与单因素分析的结果基本吻合.

通过响应面分析优化得到SSPS P1对啤酒酵母絮凝的最佳条件为SSPS P1质量浓度为11.56 mg/L、Fe3+浓度为0.26 mmol/L、pH值为 9.05、温度为30.68 ℃，絮凝率预测值为64.89%.据优化条件实验得到絮凝率为62.52%，接近预测值，说明回归模型能够反应因素对絮凝效果的影响.

3 结论

文中采用3种不同浸提剂提取的水溶性大豆多糖作为絮凝剂，絮凝酵母悬浊液.单因素实验结果表明：SSPS P1絮凝效果最好，浓度过高或过低均不利于絮凝；实验中7种金属阳离子均能激活SSPS P1和SSPS P2的絮凝活性，所有组中Fe3+与SSPS P1的组合絮凝率最高，Fe3+与SSPS P2的效果次之，其他金属离子协同SSPS的絮凝率均在20%以下；强碱性条件有利于酵母的絮凝，随pH值的增大，絮凝率增大；过高或过低的温度均不利于酵母的絮凝.综合SSPS P1质量浓度、Fe3+浓度、pH值和温度所做的响应面分析表明:SSPS P1质量浓度、pH值对絮凝率的影响极其显著，温度对絮凝效果影响显著，SSPS P1质量浓度和Fe3+存在交互作用，而4个因素对絮凝率的影响均有二次关系存在.响应面优化啤酒酵母悬浊液的最佳条件为：SSPS P1质量浓度为11.56 mg/L、Fe3+浓度为0.26 mmol/L、pH值为 9.05、温度为30.68 ℃，絮凝率预测值为64.89%，实验测得值为62.52%，与理论值接近，说明回归模型能够反应各因素对絮凝效果的影响.

[1] POWELL C D,QUAIN D E,KA S.The impact of brewing yeast cell age on fermentation performance,attenuation and flocculation [J].FEMS Yeast Research,2003,3(2)：149- 157.

[2] LIU Z,ZHANG G,LIU S.Constructing an amylolytic brewing yeastSaccharomycespastorianussuitable for accelerated brewing [J].Journal of Bioscience & Bioengineering,2004,98(6)：414- 419.

[3] WANG Q,HUANG X,NAKAMURA A,et al.Molecular characterisation of soybean polysaccharides:an approach by size exclusion chromatography,dynamic and static light scattering methods [J].Carbohydrate Research,2005,340(17)：2637- 2644.

[4] 杨晓泉,齐军茹,司华静,等.大豆多糖的研究进展及在含乳饮料、米面等食品上的应用 [J].中国食品添加剂,2008(3)：135- 139. YANG Xiao-quan,QI Jun-yu,SI Hua-jing,et al.Research on soybean soluble polysaccharide and its application in food industry [J].China Food Additives,2008(3):135- 139.

[5] 谭永辉,王文生,秦玉昌,等.豆渣中水溶性大豆多糖的提取与应用 [J].大豆科学,2008,27(1)：150- 153. Tan Yong-hui,Wang Wen-sheng,Qin Yu-chang,et al.Extraction and application of soluble soybean polysaccharides from bean curd waste [J].Soybean Science,2008,27(1):150- 153.

[6] 赵国志,刘喜亮,刘智锋.水溶性大豆多糖类开发与应用 [J].粮食与油脂,2006 (8)：15- 17. ZHAO Guo-zhi,LIU Xi-liang,LIU Zhi-feng.Development and application of soybean polysacchandes [J].Cereals & Oils,2006(8):15- 17.

[7] LI J,MATSUMOTO S,NAKAMURA A,et al.Characteri-zation and functional properties of sub-fractions of soluble soybean polysaccharides [J].Bioscience Biotechnology & Biochemistry,2014,73(12)：2568- 2575.

[8] KARR-LILIENTHAL L K,Kadzere C T,Grieshop C M,et al.Chemical and nutritional properties of soybean carbohydrates as related to nonruminants:a review [J].Livestock Production Science,2005,97(1)：1- 12.

[9] FRANSEN C T,HASELEY S R,HUISMAN M M,et al.Studies on the structure of a lithium-treated soybean pectin:characteristics of the fragments and determination of the carbohydrate substituents of galacturonic acid [J].Carbohydrate Research,2000,328(4)：539- 547.

[10] NAKAMURA A,TAKAHASHI T,YOSHIDA R,et al.Emulsifying properties of soybean soluble polysaccharide [J].Food Hydrocolloids,2004,18(5)：795- 803.

[11] 钟碧疆,高文宏.大豆多糖絮凝性研究 [J].食品科技,2011,36(5):80- 82. ZHONG Bi-jiang,GAO Wen-hong.The flocculation properties of soluble soybean polysaccharide [J].Food Science and Technology,2011,36(5):80- 82.

[12] 尹艳,高文宏,于淑娟.豆渣中水溶性大豆多糖提取工艺的研究 [J].食品工业科技,2006,27(8)：97- 98. YIN Yan,GAO Wen-hong,YU Shu-juan.Study on the extraction of soluble soybean polysaccharides from soybean by-products [J].Science and Technology of Food Industry,2006,27(8):97- 98.

[13] 孟岳成,邱蓉,张学兵.碱法提取可溶性大豆多糖的工艺 [J].食品研究与开发,2009,30(11)：83- 86. MENG Yue-cheng,QIU Rong,ZHANG Xue-bing.Stu-dies on the extraction of soybean polysaccharides from okara by alkali-extraction [J].Food Research and Development,2009,30(11):83- 86.

[14] 熊杰,杨玥熹,华欲飞.大豆渣水溶性大豆多糖提取工艺研究 [J].粮食与油脂,2009(8)：38- 40. XIONG Jie,YANG Yue-xi,HUA Yu-fei.Extraction technology of soluble soybean polysaccharides from bean dregs [J].Soybean Science,2009(8):38- 40.

[15] FURUTA H,MAEDA H.Rheological properties of water-soluble soybean polysaccharides extracted under weak acidic condition [J].Food Hydrocolloids,1999,13(3)：267- 274.

Flocculation Effect of Water Soluble Soybean Polysaccharides on Brewer Yeast Suspension

GAOWen-hongLINPing-zhouZHONGBi-jiangZENGXin-an

(School of Food Science and Engineering,South China University of Technology,Guangzhou 510640,Guangdong,China)

Three kinds of water soluble soybean polysaccharides,namely,SSPS P1,SSPS P2and SSPS P3,were extracted from soy bean dregs by using tartaric acid,sodium hexametaphosphate and sodium hydroxide.Then,the flocculation effects of the SSPS on the brewer yeast suspension with different metal cations (Al3+,Fe3+,Fe2+,Mg2+,Ca2+,K+and Na+),polysaccharide concentrations,pH values and temperatures were respectively investigated.Moreover,the response surface experiment design was performed to optimize the flocculation conditions,and a corresponding mathematical regression model was constructed.Single factor research results show that (1) SSPS P1has the best effect in flocculating the brewer yeast suspension;(2) most of the metal cations increase the flocculation effects,among which Fe3+shows the best performance;(3) when the Fe3+concentration reaches 0.025 mmol/L,the best flocculation effect can be achieved;(4)the flocculation effects can also be influenced by the SSPS P1concentration and the temperature,and the effects are better at 10 mg/L and 30 ℃;and (5) a strong alkaline environment is helpful in adopting SSPS P1to flocculate the brewer yeast suspension.The analytical results based on the constructed model indicate that the optimal flocculating condition is a SSPS P1mass concentration of 11.56 mg/L,a Fe3+concentration of 0.26 mmol/L,a pH value of 9.05 and a temperature of 30.68 ℃,and the experimental value of the flocculating rate under the optimal condition is very close to the predicted one,which means that the constructed model can reflect the influence of various factors on the flocculation effect.

water soluble soybean polysaccharides;flocculation;brewer yeast suspension;metal cation;response surface methodology

2015- 07- 15

国家自然科学基金资助项目(21376094)；广东省科技计划项目(2013B020203001,2012A020200002) Foundation items: Supported by the National Natural Science Foundation of China(21376094)and the Science and Technology Program of Guangdong Province(2013B020203001,2012A020200002)

高文宏(1970-)，女，博士，副教授，主要从事食品质量与安全方面的研究.E-mail：gaowh@scut.edu.cn

1000- 565X(2016)10- 0125- 07

TS 201.2

10.3969/j.issn.1000-565X.2016.10.018