杨 凯， 李 磊， 龙光强， 孟珍贵， 李龙根， 陈军文*

( 1. 云南农业大学 云南省优势中药材规范化种植工程研究中心， 昆明 650201；2. 云南农业大学 农学与生物技术学院， 昆明 650201 )

顽拗性三七种子后熟过程超微结构和抗氧化酶变化

杨 凯1,2， 李 磊1,2， 龙光强1， 孟珍贵1， 李龙根1， 陈军文1,2*

( 1. 云南农业大学 云南省优势中药材规范化种植工程研究中心， 昆明 650201；2. 云南农业大学 农学与生物技术学院， 昆明 650201 )

该研究以3年生三七成熟种子为材料，通过对三七种子种胚切片观察、抗氧化酶活性测定及相关基因表达量的变化分析，从生理、形态及转录组3个层面了解顽拗性三七种子的内在机理。结果表明：三七种子后熟0～40 d，超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)和谷胱甘肽还原酶(GR)的活性先升高后降低，过氧化物酶(POD)的活性升高。后熟40 d时SOD、POD、CAT、APX相关差异表达基因的FPKM值分别为28、13、356、105，皆处于较高水平，此时观察到完整的细胞结构，种胚完成形态成熟，丙二醛(MDA)含量达到了最高值，说明三七种子内部抗氧化系统抵御氧化伤害最激烈，对水分胁迫造成的氧化伤害最为敏感。伴随后熟时间的延长，膜脂过氧化作用加剧造成细胞膜的降解，导致细胞功能丧失和畸形死亡，抗氧化系统酶活性降低不能有效抵御氧化伤害可能是导致顽拗性三七种子脱水敏感的重要原因之一。

三七， 后熟作用， 脱水敏感性， 超微结构， 抗氧化系统

三七(Panax notoginseng)为五加科(Araliaceae)人参属多年生草本植物，是我国特有的名贵中药材，有“南国神草”的美誉。三七主产地和地道产区为云南省文山州，种植面积和产量均占全国的比例在90%以上。三七含有多种皂苷、氨基酸、多糖和黄酮等生理活性物质(张铭，2003)，其根、茎、花均可入药，具有散瘀止血、消肿止痛、降脂、降血糖、提高机体免疫力和抗心肌缺血等功效(付建华等，2006)。三七作为具有确切的预防、医疗和保健功能的天然药物，在药品、保健品、功能食品领域具有巨大的开发潜力和市场前景。

顽拗性种子是指在成熟过程中不发生脱水行为，种子在成熟脱落时仍然保持着较高的含水量(Smith&Berjak，1995)，在整个生长发育过程对脱水和低温敏感(Pammenter&Berjak，1999)。目前国内外对种子休眠及种子脱水耐性的分子机理尚不十分明确(李晓琳等，2011)，研究表明种子超微结构及其代谢活性变化与种子在生长发育过程中脱水耐性的获得有着密切的联系(Farrantetal，1997)。顽拗性种子在脱水过程中，种子内部发生水介导的氧化伤害，即种子含水量处于中等水平时，其内部将会发生一种不受控制的氧化反应，可对种子造成脱水伤害(Leprinceetal，1996)。种子内部存在的抗氧化防御系统，可以对抗种子劣变过程中所产生的超氧阴离子自由基，酶促防御系统和非酶促防御系统共同构成抗氧化系统，前者包括SOD(超氧化物歧化酶)、POD(过氧化物酶)及CAT(过氧化氢酶)等(Cakmaketal，1993)。当抗氧化系统酶活性下降时，种子就会发生氧化胁迫伤害。因此，在脱水过程中酶促防御系统未能对膜脂过氧化事件进行有效的抵御也可能是顽拗性种子脱水敏感性的重要原因。三七种子在成熟采收后保持着较高的含水量，在后熟过程中伴随着一定程度水分的丧失。

种子繁殖是三七农业生产上应用最为广泛的繁殖方式，然而三七种子为典型的顽拗性种子，对脱水和低温高度敏感(李磊等，2014)，种子在完成形态成熟时含水量约为67.3%，此时种胚尚未完全分化，需经过60～100d的后熟期才能开始萌发，属生理休眠类型(安娜，2006)。由于三七种子的典型顽拗性，严重阻碍着三七种子的贮藏保存。本文在前人研究的基础上，对后熟不同时期的三七种子进行种胚切片观察、抗氧化系统酶活性及相关基因表达量的变化分析，试图从解剖学、生理学和分子生物学层面探讨三七种子脱水敏感性的原因。

1 材料与方法

1.1 供试材料

三七(Panax notoginseng)种子采自于云南省文山州的文山市苗乡三七实业有限公司苗乡三七科技公司的试验基地。试验基地位于文山州砚山县盘龙乡。

1.2 实验设计

选择成熟、饱满的3年生植株的种子，人工搓去果皮，用5%CuSO4浸泡消毒，将种子冲洗干净，用滤纸吸干表面水分后与经高温消毒后的湿沙按1∶5层积保存。自2014年11月19日，以每10d的间隔进行取样，分别进行种子超微结构观察及抗氧化系统酶生理指标的测定；部分种子液氮冻存，备用于转录组测序。

1.3 实验方法

1.3.1 超微结构观察 超微结构观察实验前期样品处理方法参照(Wenetal，2009)的方法，并稍作修改。将处于不同后熟阶段的种子去掉种皮，切去种胚生长部位1cm3左右样品，放入含2.5 % 戊二醛的0.2mol·L-1磷酸缓冲液(pH7.2)中，4 ℃下固定24h后经2%的锇酸固定3h，用50%、70%、80%、90%乙醇梯度脱水各15min，再用100%乙醇脱水3次，每次30min，Epon812环氧树脂包埋。用LKB-v型超薄切片机切片，切片经醋酸铀和柠檬酸铅染色后，在透射电子显微镜下观察拍照。选取不同后熟期最清晰的电镜图，使用标尺计算细胞器的大小。

1.3.3 与抗氧化系统相关差异表达基因筛选 通过IlluminaHiseqTM2500测序技术获得三七种子4个后熟时期(0、20、40、60d)的转录本信息，并筛选出与抗氧化系统酶相关的基因，用FPKM(每百万fragments中来自某一基因每千碱基长度的fragments数目)来估算不同后熟期的基因表达水平(Trapnelletal，2010)。

1.4 数据统计分析

不同后熟时期抗氧化酶活性及氧化产物含量和抗氧化酶相关基因的FPKM值使用SPSS17.0单因素方差分析和Duncan多重比较方法进行显著性差异分析，P值≤0.05时视为差异显著。试验独立重复3次(n=3)。

2 结果与分析

2.1 超微结构观察

三七种子后熟过程中，经透射电子显微镜观察后所得到的超微结构的变化情况如图1所示。刚成熟的三七种子细胞整齐饱满，中央大液泡发达，细胞壁内侧紧密排列着大量形状大小相对统一的椭圆形黑色脂质体，脂质体长轴的长度一般约为0.1nm(图1：a)。层积保存20d时，细胞壁明显增厚，厚度约为初始时期的2倍，脂质体排列间隔变大，颜色变为半透明(图1：b)。层积保存30d时观察到了明显的液泡，脂质体大小不一分散在细胞内，并且首次观察到了淀粉体，淀粉体长约2.3μm，宽约1.36μm(图1：c)。层积保存40d，可以观察到典型的椭圆形细胞核结构，核内有核仁直径约0.15nm，细胞内出现了大量的液泡，脂质体颜色逐渐变深，在细胞壁内侧不断积累(图1：d-e)。层积保存50d时，细胞核较之前变小，核仁直径约为0.09nm，细胞内的脂质体又重新聚集在细胞壁的内侧(图1：f-g)；层积保存60d时，可观察到细胞壁逐渐向内凹陷，细胞形状畸形，细胞间隙变大，液泡消失，出现了大量的形状大小规则的淀粉粒，长约0.89μm，宽约0.64μm，脂质体分散排列在细胞壁内侧(图1：h)。

2.2 抗氧化系统酶活性及氧化产物生成量测定

三七种子后熟过程中SOD、POD、CAT、APX、GR酶活性及GSH含量的变化趋势各不相同。SOD和POD酶活性变化见图2：a,b，SOD酶活性呈现升降交替的变化趋势，20d时达到整个过程最大值29.8U·g-1·min-1，到40d时下降到最低值3.63U·g-1·min-1；POD酶活性在后熟期40d时达到整个后熟过程的最高值(5.40U·g-1·min-1)，显著高于其他后熟时期(P<0.05)，随后呈现逐渐降低的趋势。抗氧化酶CAT、APX酶活性变化如图2：c,d所示，CAT酶活性整体呈现出逐渐上升的变化趋势，在后熟期60d时达到最大值(4.29U·g-1·min-1)，随后逐渐下降。APX酶活性整体呈现出上下交替的变化趋势，在后熟期60d时，酶活达到最小值(2.55U·g-1·min-1)，而70d时上升至最大值(4.16U·g-1·min-1)。GR酶活性和GSH含量变化见图2：e,f，GR酶活性在后熟期初期呈现上升趋势，30d时达到整个后熟过程最大值(0.58U·g-1·min-1)，随后呈现逐渐缓慢下降趋势。GSH含量在整个后熟过程呈现出升降交替的变化趋势，其中在20d时达到最大值(1.18mmol·g-1)，随后直线下降至40d时出现最小值(0.56mmol·g-1)。

2.3 与抗氧化系统相关差异表达基因的筛选与分析

为明确三七种子后熟期抗氧化系统功能的分子机理，在所得的三七种子转录组数据库中，筛选出后熟过程中与抗氧化系统有关酶的差异表达基因共87条，其中与SOD、POD、CAT、APX、GR和GSH合成酶相关差异表达基因分别有25、32、17、4、7、2条。SOD家族相关基因表达量呈现先降后升的趋势(图4：a)，后熟20 d时 FPKM值最小为19.39，随后开始不断升高，后熟40 d时为28.45，到后熟60 d时达到最大值为29.59。POD类基因表达量FPKM值总体呈现升高趋势(图4：b)，后熟0 d为最小值6.28，后熟40 d为12.96，后熟60 d时达到最大值18.55。

图 1 三七种子后熟过程各时期的超微结构 CW. 细胞壁； L. 脂质体； V. 液泡； Am. 淀粉体；Nu. 核仁； N. 细胞核；Is. 细胞间隙。标尺a, b, d, f=0.2 nm； 标尺c, h=2 μm； 标尺e=1 μm；标尺g= 5 μm。Fig. 1 Electron micrographs of sections from the seed of Panax notoginseng during after-ripening process of embryo growth CW. Cell wall; L. Lipid; V. Vacuole; Am. Amyloplast; Nu. Nucleolus; N. Nucleus; Is. Ntercellular space. Scale bars: a, b, d, f=0.2 nm; c, h = 2 μm; e = 1 μm; g = 5 μm.

图 2 三七种子后熟过程中超氧化物歧化酶 (SOD, a)、过氧化物酶 (POD, b)、过氧化氢酶 (CAT, c)、抗坏血酸过氧化物酶 (APX, d)和谷胱甘肽还原酶 (GR, e)活性及还原型谷胱甘肽 (GSH, f)含量的变化 数据是平均值 ± 标准误(n=3)。下同。Fig. 2 Changes in activities of SOD (a), POD (b), CAT (c),APX (d), GR(e) in the process of embryo growth after-ripening of Panax notoginseng seed and content of GSH(f) Values for each point were (n=3). The same below.

图 3 三七种子后熟过程中脂质过氧化物丙二醛(MDA, a)、超氧阴离子·, b)含量的变化Fig. 3 Changes in content of MDA (a) and ·(b) in the process of embryo growth after-ripening of Panax notoginseng seed

图 4 三七种子后熟过程中超氧化物歧化酶(SOD, a)和过氧化物酶(POD, b)过氧化氢酶(CAT, c)、抗坏血酸过氧化物酶(APX, d)和谷胱甘肽还原酶(GR, e)及还原型谷胱甘肽(GSH, f)相关基因的FPKM值Fig. 4 FRKM related to SOD (a), POD (b), CAT (c), APX (d), GR (e) and GSH (f) of Panax notoginseng seed at different after-ripening stages

CAT类是所有抗氧化系统相关酶基因中差异表达量最高的，FPKM值的变化规律为先升后降(图4：c)，后熟0 d的FPKM值最低为189.54，后熟20 d达到最大值335.16，随后出现缓慢下降趋势，后熟40 d时为356.44。APX类基因表达量在整个后熟过程中持续升高(图4：d)，后熟0 d FPKM值为61.32，后熟20 d和40 d增幅较平缓，40 d时为104.77，到后熟60 d升至最大值120.66。GR类基因表达量表现出先降后升(图4：e)，FPKM值在后熟0 d为最大值(23.87)，随后出现缓慢下降趋势，在后熟40 d出现最低值(19.81)。GSH相关基因表达量FPKM值在整个后熟过程中表现为升降交替变化(图4：f)，于20 d达到最大值(12.83)，随后开始下降至后熟40 d为最低值(7.61)。

3 讨论

在组织中，当编码酶促抗氧化剂的基因增量表达时，由氧化事件引起的细胞毒素产物的清除对于提高脱水胁迫耐性具有重要意义(Ingram & Bartels，1996)。三七种子后熟过程中，SOD相关基因在种子种胚形态生长期少量表达，说明此时种子内部受到的氧化胁迫较小，而在种子后熟40 d时表达量明显增加，这也验证了此时种子内部所受氧化伤害程度严重的结果。POD相关基因在后熟期差异表达总体上呈现持续升高，说明在整个后熟过程中POD起到了抵御氧化伤害的作用。CAT相关基因差异表达量最高，可见该基因对三七种子所受氧化伤害较为敏感。APX相关基因表达量在整个后熟期持续升高，而酶活性在后熟40 d和60 d时较低，推测后熟60 d时种子内所受到由H2O2引起的氧化伤害程度最为严重。GSH受谷胱甘肽合成酶基因调控，其差异表达量在各时期相对较小，后熟期20 d时表达量最高，推测种子在后熟20 d时GR和GSH发挥着重要的ROS清除功能。可见，三七种子后熟过程中每种抗氧化酶基因的表达模式都是独特而又复杂的。

总的来看，三七种子后熟过程中，SOD、POD、CAT、APX相关差异表达基因的FPKM值总体呈现升高趋势。后熟前20 d，SOD、APX、GR活性升高，对氧化伤害起到抵御作用；后熟40 d时，细胞代谢活性最强，种胚完成形态成熟，SOD、POD、CAT、GR活性下降，MDA大量积累，此时种子对氧化伤害最为敏感；后熟60 d时膜脂过氧化加剧，抗氧化系统酶活性降低，导致细胞功能的丧失和畸形死亡。由此可见，抗氧化酶系统不能有效抵御氧化伤害可能是导致三七种子脱水敏感性的重要原因之一。

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乡村地区有别于城市，资金来源有限，主要是靠公共财政支出。但乡村的公共财政支出有限，所以需要“花小钱办大事”，提高资金使用效率，平衡进度、成本、质量，需要抓住机会建设出实打实的效果，快速地出效果并不意味着急于求成，这样可以充分提高各参建单位以及当地民众的积极性。EPC建造模式合同清晰明确，有效避免责权不清，可以充分发挥总承包商的管理能力，全面协调各方面，确保项目的质量和进度，有效实现预期目标。

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Changes of antioxidant enzyme and ultrastructure in recalcitrant seeds ofPanaxnotoginsengduring after-ripening process

YANG Kai1,2, LI Lei1,2, LONG Guang-Qiang1, MENG Zhen-Gui1,LI Long-Gen1, CHEN Jun-Wen1,2*

( 1. Yunnan Provincial Research Center on Good Agricultural Practice for Dominant Chinese Medicinal Materials, Yunnan Agricultural University,Kunming 650201, China; 2.CollegeofAgronomyandBiotechnology,YunnanAgriculturalUniversity, Kunming 650201, China )

The changes in ultrastructure, activity of antioxidant enzyme and expression of antioxidant enzyme were examined in 3-year-oldPanaxnotoginsengseeds during the after-ripening process. The objective of the present study was to analyze the desiccation sensitivity in recalcitrant seeds ofP.notoginsengat the physiological, ultrastructural and transcriptomic levels. The results showed that during after-ripening process of 40 d, the activity of SOD, CAT, APX and GR in seeds increased at first and then reduced, and POD activity gradually increased. At the end of after-ripening period of 40 d, FPKM values of gene related to antioxidant enzymes (SOD, POD, CAT and APX) were 28, 13, 356 and 105, respectively, and all at a high. At the same time, intact cell structure was observed, and mature embryo was morphologically completed. However, the amount of MDA reached a peak value. Summarily, the peroxidations of membrane lipid caused cell membrane degradation and led to cell function loss and even cell death; meanwhile, antioxidant enzymes could not effectively resist the oxidative injury with the prolonged time of after-ripening, which may be the vital reasons for desiccation sensitivity in recalcitrant seeds ofP.notoginseng.

Panax notoginseng,after-ripening,desiccationsensitivity,ultrastructure,antioxidantsystem

10.11931/guihaia.gxzw201510018

2015-10-15

2016-01-18

国家自然科学基金(81360609)；云南省中青年学术技术带头人后备人才培养项目(2014HB011) [Supported by the National Natural Science Foundation of China (81360609); the Project of Young and Middle-aged Talent of Yunnan Province (2014HB011)]。

杨凯(1993-)，女(彝族)，云南普洱人，硕士研究生，主要研究方向为种子生理学，(E-mail)flove102@163.com。

*通讯作者： 陈军文，博士，教授，主要研究方向为药用植物生理生态，(E-mail) cjw31412@163.com。

Q946

A

1000-3142(2016)12-1519-07

杨凯，李磊，龙光强，等. 顽拗性三七种子后熟过程超微结构和抗氧化酶变化 [J]. 广西植物， 2016， 36(12):1519-1525

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