罗秋莲，唐专辉，张雪凤，王立升,2，林翠梧,2，罗 轩,2

(1.广西大学化学化工学院， 广西南宁530004；2.广西大学广西高校应用化学技术与资源开发重点实验室， 广西南宁530004)

铁皮石斛多糖的分离纯化及其结构研究

罗秋莲1，唐专辉1，张雪凤1，王立升1,2，林翠梧1,2，罗 轩1,2

(1.广西大学化学化工学院， 广西南宁530004；2.广西大学广西高校应用化学技术与资源开发重点实验室， 广西南宁530004)

采用DEAE-52阴离子交换柱色谱法以及Sephadex G-100凝胶柱色谱法对铁皮石斛粗多糖进行分离纯化，得到4个不同相对分子质量(Mw)纯多糖组分(DOP1、DOP2、DOP3和DOP4)。运用柱前衍生化高效液相色谱法、凝胶渗透色谱(GPC)法和傅立叶红外光谱对其单糖组成、纯度和相对分子质量以及结构中单糖连接方式进行分析。研究结果表明：分离得到的4种铁皮石斛多糖的GPC色谱图均呈现为单一狭窄的对称峰，表明多糖纯度很高且均一性很好。单糖组成测定结果显示其主要为D-甘露糖和D-葡萄糖组成杂多糖，但D-甘露糖和D-葡萄糖的摩尔比在4种多糖中有一定差异性。红外光谱结果表明这四个多糖均为β-构型为主的酸性吡喃糖。研究结果可为今后铁皮石斛多糖活性和构效关系的研究奠定基础。

铁皮石斛多糖；相对分子质量；单糖组成；化学成分分析

铁皮石斛(Dendrobiumofficinale)是兰科石斛属类植物，自古以来就拥有“药中黄金”的美誉。在道家医学经典《道藏》中，铁皮石斛被列为中华九大仙草之首。在我国传统医学中，铁皮石斛为常用贵重药材，具有滋阴清热、生津益胃、润肺止咳等功能，用于热病伤津、口干烦渴、病后虚热等多种病症[1-2]，药用历史悠久。研究表明，多糖在铁皮石斛的成分中含量最高，也是其主要活性物质[3]，并具有多种药理活性[1-4]。多糖是自然界广泛存在的四种生物信息大分子之一[5]，作为生命物质的重要组成成分，不仅广泛参与各种生命活动[6]，并且还具有提高机体免疫力、抗病毒、抗衰老、抗肿瘤、降血糖、降血脂以及抗氧化能力等作用[7]。近年来，铁皮石斛多糖的研究越来越深入。有研究表明其活性与多糖的组成具有重要的关系[8]。但相比活性的研究，目前对铁皮石斛多糖成分的报道还较少。因此，本工作对铁皮石斛多糖成分开展研究，旨在为进一步深入探究铁皮石斛多糖的结构和药理活性奠定一定的基础，并且为铁皮石斛开发和利用提供重要的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

材料：铁皮石斛干茎样品由广西御仙斛生物科技有限公司提供，并经过该公司的植物学专家鉴别。样品经过90 ℃烘干，粉碎，过100目筛备用。

试剂：DEAE-cellulose-52填料(上海源叶生物科技有限公司)；Sephadex G-100填料(Sigma-Aldrich公司)；甲醇和乙腈(Thermo Scientific公司)；不同分子量的葡聚糖标准品(Fluka公司)；其他所用到的化学试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

FD-1A-50冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限责任公司)；LYNX6000高速离心机(Thermo Scientific公司)；Waters e2695液相色谱仪(美国Waters公司)；DPCS型紫外分光光度计(尤尼科仪器有限公司)；Mili-Q Advantage A10超纯水系统(美国Millipore公司)；Nicolet iS50 FT-IR红外光谱仪(美国Thermo Scientific公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 铁皮石斛粗多糖的提取

采用水提醇沉法提取铁皮石斛多糖。具体工艺流程：铁皮石斛干茎样品→粉碎机粉碎→于阴处晾干→85%乙醇醇泡1 d→离心、抽滤→将滤渣于阴处晾干→75 ℃热水浸提滤渣3次→离心、抽滤→合并滤液→减压浓缩至700 mL→85%乙醇醇沉过夜→离心分离→真空冷冻干燥→得率为10.4%的粗多糖(DOP)

1.3.2 铁皮石斛粗多糖的分离纯化

准确称量DOP 1.0 g，并将其配成浓度为10 mg/mL的多糖溶液，采用Sevag法(V氯仿∶V正丁醇=4∶1)按3∶1的体积对其进行脱蛋白处理。取脱蛋白后粗多糖0.5 g溶于适量超纯水。取其上清液用DEAE-52阴离子交换柱色谱(2.6 cm ×50 cm)进行脱色与分离。以去离子水进行洗脱，等量接收(3.0 mL/管)。并以苯酚—硫酸法检测管中的糖含量。合并所有含糖组分，浓缩冻干后备用。取上一步纯化后多糖样品溶于2 mL超纯水。其上清液经Sephadex G-100凝胶柱色谱(2.0 cm × 80 cm)纯化，以去离子水作为洗脱液，流速为0.6 mL/min，等量接收(3.0 mL/管)，以苯酚—硫酸法跟踪检测糖含量，合并所有含糖组分，浓缩后冻干，得到4个不同分子量的铁皮石斛纯多糖DOP1、DOP2、DOP3和DOP4，收率为60.88%。

1.3.3 不同分子量多糖的化学成分分析

①多糖的紫外光谱分析

分别取适量的DOP1、DOP2、DOP3和DOP4多糖样品并且溶解于去离子水后，于190～400 nm范围内进行紫外光谱扫描。

②多糖纯度及相对分子质量的测定

准确称取经Sephadex G-100凝胶柱色谱纯化所得的DOP1、DOP2、DOP3和DOP4多糖样品各4 mg，分别配成浓度为2 mg/mL的多糖溶液。根据Alosp等[9]所描述的方法，用不同相对分子质量葡聚糖标准品(5 200、11 600、23 800、273 000和410 000)来建立标准曲线，采用凝胶渗透色谱法对不同分子量铁皮石斛多糖的纯度和相对分子质量进行测定[10]。色谱条件：UltrahydrogelTM500、250和120色谱柱(7.8×300 mm)三柱串联；柱温为35 ℃，流动相为超纯水，流速为1.0 mL/min，进样体积为30 μL，运行时间为40 min。

③多糖中单糖组成的测定

采用柱前衍生化-HPLC法进行单糖组成分析[11-13]。样品的处理：准确称取铁皮石斛多糖样品(DOP1、DOP2、DOP3和DOP4)各10 mg置于4个安瓿管中，加入浓度2 mol/L的三氟乙酸溶液2 mL，真空封管，于110 ℃条件下反应水解12 h。水解完成待样品冷却至室温后，于70 ℃水浴中加热30 min，得到多糖的水解产物。标准曲线的绘制：精确称取鼠李糖、甘露糖、木糖、半乳糖醛酸、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸、半乳糖和葡萄糖单糖标准各50 mg，制备单糖标准品和混和标准品母液。通过单糖标准品进行定性，再对照混和标准品母液绘制成的标准曲线的保留时间以及峰面积进行分析鉴定。色谱条件：色谱柱为C18柱(4.6 mm×250 mm)；柱温为25 ℃，流动相为磷酸盐缓冲液(0.05 mol/L, pH=6.8)和乙腈混合溶液以8∶2的比例进行等度洗脱，进样量为20 μL，流速为1 mL/min，检测波长为245 nm。

④多糖的傅立叶红外光谱分析

分别取干燥后的DOP1、DOP2、DOP3和DOP4各约1 mg，用KBr压片，在4000～400 cm-1范围内进行扫描。

2 结果与分析

2.1 总多糖含量测定与多糖提取率的计算结果

以葡萄糖为标样作标准曲线，得到回归方程为y=16.123x+0.036 4，R2=0.993 4，其在葡萄糖浓度为0～80 mg/L范围内线性关系良好。根据水提醇沉提取多糖的工艺得到所有粗多糖质量与干燥的药材质量之比即为铁皮石斛多糖提取率。在本实验中铁皮石斛多糖的提取得率为10.4%。

2.2 多糖纯度及相对分子质量的测定结果

DOP1、DOP2、DOP3和DOP4的GPC色谱图(图1)上均为单一狭窄对称峰，表明4种多糖纯度很高且相对分子质量分布均一。依据DOP1、DOP2、DOP3和DOP4的保留时间，通过葡聚糖标准曲线计算出DOP1、DOP2、DOP3和DOP4的相对分子质量(Mw)分别约为5 302、4 699、5 480、5 408。

(a) DOP1

(b) DOP2

(c) DOP3

(d) DOP4

图1 DOP1、DOP2、DOP3和DOP4的GPC色谱图
Fig.1 GPC spectrum of DOP1,DOP2, DOP3, and DOP4

2.3 多糖中单糖组成的测定结果

单糖混合标准品中各种单糖的保留时间及其峰面积百分比见表1。8种单糖混合标准品衍生化后的高效液相色谱图如图2所示。铁皮石斛多糖DOP1、DOP2、DOP3和DOP4的水解产物经1-苯基-3-甲基-5-吡唑酮(PMP)衍生化后的HPLC色谱图如图3显示。由图3可知，4种分离得到的铁皮石斛多糖均为D-甘露糖和D-葡萄糖的杂多糖。其中，DOP1是由甘露糖、葡萄糖醛酸和葡萄糖以3.42∶0.11∶1.08的摩尔比组成的；DOP2是由甘露糖和葡萄糖以8.56∶1.12的摩尔比组成的；DOP3是由甘露糖和葡萄糖以4.91∶1.09的摩尔比组成的；DOP4是由甘露糖和葡萄糖以3.61∶1.01的摩尔比组成的。结果表明这四种多糖中的D-甘露糖、D-葡萄糖的摩尔比存在一定的差异性。

表1 混合单糖标准品保留时间及其峰面积百分比
Tab.1 The retention time and peak area percentageof mixed monosaccharide standard

单糖种类保留时间/min峰面积的百分比/%甘露糖8892611葡萄糖醛酸11391045鼠李糖11901562半乳糖醛酸12641476葡萄糖16111034半乳糖1785865木糖1892772阿拉伯糖1952636

图2 混合单糖标准品的HPLC色谱图
Fig.2 HPLC spectrum of mixed standard saccharides

(a) DOP1

(b) DOP2

(c) DOP3

(d) DOP4

图3 DOP1、DOP2、DOP3和DOP4的HPLC色谱图
Fig.3 HPLC spectrum of DOP1, DOP2, DOP3,and DOP4

2.4 傅立叶红外光谱分析

多糖中的一些基本官能团在红外光谱区中均有特征吸收峰，因此,可以用红外光谱区中的特征吸收峰对多糖进行分析。DOP1、DOP2、DOP3和DOP4的红外光谱图如图4所示。可见，4种多糖均在3 390 cm-1处有羟基的很强伸缩振动吸收峰，2 928 cm-1和2 884 cm-1处均有甲基和亚甲基的较弱伸缩振动吸收峰。在1 200～1 000 cm-1范围内的3个较弱吸收峰1 042、1 067、1 096 cm-1是吡喃糖环的特征吸收峰，来自于吡喃糖环的(C—O—H)伸缩振动和(C—O—C)糖苷键的非对称振动吸收峰[14]。说明DOP1、DOP2、DOP3和DOP4都具有吡喃糖苷结构。

4种铁皮石斛多糖的红外光谱图中，1 730～1 740 cm-1处的吸收峰为羧酸或者乙酰氧基上的C=O的伸缩振动吸收峰，表明其为酸性多糖；800～880 cm-1有两个明显吸收峰，说明含有β-构型的甘露吡喃糖苷键。因此，这4种多糖均是以β-构型为主的吡喃酸性杂多糖。

(a) DOP1

(b) DOP2

(c) DOP3

(d) DOP4

图4 DOP1、DOP2、DOP3和DOP4的红外光谱图
Fig.4 FT-IR spectrum of DOP1， DOP2， DOP3and DOP4

3 结 语

本研究分离得到的DOP1、DOP2、DOP3和DOP4等4种铁皮石斛多糖相对分子质量分布都很均一。其单糖组成测定结果显示这4种多糖均是由D-甘露糖和D-葡萄糖组成的杂多糖，且这4种多糖中各单糖组成的摩尔比存在一定的差异性。铁皮多糖所具有的药理活性往往与其单糖组成的类型与单糖组成的摩尔比有一定的联系。本工作明确了分离得到的4种铁皮石斛多糖的单糖组成及摩尔比例，为日后对铁皮石斛多糖结构及其药理活性研究提供了重要的数据。红外光谱分析可知，4种多糖均为含有β-构型的甘露吡喃型酸性多糖。

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(责任编辑 张晓云 裴润梅)

Isolation, purification, and chemical composition analysis of polysaccharides from Dendrobium officinale

LUO Qiu-lian1, TANG Zhuan-hui1, ZHANG Xue-feng1, WANG Li-sheng1,2, LIN Cui-wu1,2, LUO Xuan1,2

(1.School of Chemistry and Chemical Engineering, Guangxi University, Nanning 530004, China;2.Guangxi Colleges and Universities Key Laboratory of Applied Chemistry Technology and Resource Development, Guangxi University, Nanning 530004, China)

Crude polysaccharide fromDendrobiumofficinalewas successively isolated and purified by DEAE-52 cellulose anion-exchangechromatography and Sephadex G-100 gel-permeation chromatography and four polysaccharides named DOP1, DOP2, DOP3and DOP4were obtained with different molecular weights (Mw), respectively. Subsequently, the chemical composition of four polysaccharides, the purity and molecular weight of polysaccharides, and the interlinking style of monosaccharide in the molecular structure were determined by high-performance liquid chromatography with pre-column derivatization, gel permeation chromatography (GPC), and fourier transform infrared spectrometry method. GPC analysis indicated that the polysaccharides were homogeneous with a single symmetrical peak. Monosaccharide analysis showed that four polysaccharides were mainly composed of D-Man and D-Glc and demonstrated to be hetero-polysaccharide, while the mole ratios of D-Man and D-Glc in four polysaccharides were significantly different. The infrared spectrum analysis revealed that four polysaccharides were verified to be β-dominating configuration in acidic pyranose form sugars. The results of this workmay be useful for future study on the activity and structure-activity relationship of polysaccharides inDendrobiumofficinale.

Dendrobiumofficinalepolysaccharide; relative molecular weight; monosaccharide composition; chemical composition analysis

2016-03-14；

2016-07-03

广西自然科学基金青年基金项目(2013GXNSFBA019024)

罗 轩(1980—)，男，广西荔浦人，广西大学副教授，博士；E-mail: luo-xuan625@hotmail.com。

罗秋莲，唐专辉，张雪凤，等.铁皮石斛多糖的分离纯化及其结构研究[J].广西大学学报(自然科学版)，2016，41(6)：2060-2066.

10.13624/j.cnki.issn.1001-7445.2016.2060

O629.12

A

1001-7445(2016)06-2060-07