吉耀华， 刘 畅， 齐 莹， 马艳萍， 黄郁静， 柳中洋， 阮 强

(中国医科大学附属盛京医院 病毒室，辽宁 沈阳 110004)

人巨细胞病毒UL55编码蛋白结合蛋白的筛选与鉴定

吉耀华， 刘 畅， 齐 莹， 马艳萍， 黄郁静， 柳中洋， 阮 强*

(中国医科大学附属盛京医院 病毒室，辽宁 沈阳 110004)

从人胎脑cDNA文库中筛选和鉴定出与人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus，HCMV) UL55编码蛋白结合的蛋白。将UL55基因编码区克隆到诱饵载体pGBKT7中，在证实UL55蛋白不具有自激活作用的前提下，采用Match-maker GAL酵母双杂交系统筛选人胎脑cDNA文库中与UL55蛋白结合的宿主蛋白，用酵母双杂交回转实验验证UL55蛋白与获得的蛋白结合的可靠性。将酵母双杂交筛选出的文库蛋白烯醇化酶1(enolase1, ENO 1)构建到pGEX-4T-2载体上，利用GST pull-down技术体外验证ENO 1与HCMV UL55蛋白的结合。 并依据所筛选出蛋白的生物学功能分析UL55蛋白可能的生物学功能。结果显示有10种蛋白与HCMV UL55编码蛋白结合。应用GST pull-down技术检测到ENO 1 与HCMV UL55相互结合的蛋白条带。成功地筛选出10种与UL55蛋白相互结合的宿主蛋白，GST pull-down实验进一步表明ENO 1可以与HCMV UL55蛋白直接结合，为进一步研究UL55蛋白的功能提供了新的线索。

人巨细胞病毒；UL55编码蛋白；人胎脑cDNA 文库；ENO 1；相互结合

人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus，HCMV)是引起艾滋病、器官移植及免疫功能缺陷患者的致病原，同时也是引起围生期感染、新生儿疾病和先天畸形的重要病原体；HCMV先天感染可引起小儿黄疸型肝炎、先天性巨结肠、肝脾肿大、胆道闭锁、神经性耳聋、小头畸形和颅内钙化等多种消化系统和神经系统疾病或畸形，严重者发生全身性感染综合征[1-2]。在无症状感染的新生儿中，10%～17%在出生后1年或数年出现迟发性神经系统发育障碍, 表现为智力发育迟缓、听力缺失等[3]。HCMV是人疱疹病毒科中已知基因组最大的病毒，能编码200多种蛋白质,包括超过65种糖蛋白，其中至少有10种包膜糖蛋白。糖蛋白B(glycoprotein B，gB) 是由HCMV UL55基因编码，是 HCMV包膜中最丰富的糖蛋白，占包膜蛋白的一半以上。gB蛋白卷曲在成熟病毒颗粒的包膜上，与病毒增殖周期中的吸附、融合密切相关[4-5]，而且gB蛋白具有强抗原性, 是中和抗体的关键靶目标，且参与细胞应答反应，是HCMV潜在的毒力因素。鉴于gB 蛋白在HCMV 感染中的重要作用，为进一步探讨gB蛋白生物学特性，本研究采用酵母双杂交技术从人胎脑cDNA文库中筛选出与gB蛋白相互结合的蛋白，并采用分子生物学方法研究UL55基因编码的gB蛋白生物学特性。

1 材料与方法

1.1 材料

样本采用中国医科大学盛京医院病毒室分离的临床低传代HCMV分离株Han株，且传代小于5 次。HCMV分离株Han在GenBank收录中序列号为GQ981646。Match-maker GAL Two-Hybrid System的酵母双杂交系统购自Clontech公司；MatchmakerTMcDNA Libraries人胎脑cDNA文库由中国科学院武汉病毒研究所肖庚富(教授)赠予。采用Sigma公司的相关筛选试剂； DNA测序由Invitrogen公司完成。

1.2 方法

1.2.1 酵母表达重组质粒pGBKT7-UL55的构建 将HCMV分离株Han感染人胚肺成纤维细胞并提取DNA，以此作为HCMV UL55基因扩增模板。按照HCMV分离株Han 基因序列，应用软件primer 5.0 设计引物，用于扩增HCMV UL55 的编码序列，通过引物的5′末端引入载体pGBKT7的多克隆位点序列的EcoRⅠ和BamHⅠ两个识别位点(下划线)并加入保护性核苷酸。上游引物序列：5′-CGCGAATTCGAATCCAGGATCTGGTGCCTG-3′(含EcoR Ⅰ酶切位点)；下游引物序列：5′-CGCGGATCCATAGAGCCAGGTGCTGCCGCG-3′(含BamHⅠ酶切位点)，引物序列见表1。PCR反应体系为50 μL，PCR 条件为94 ℃预变性4 min，94 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30个循环，72 ℃再延伸10 min。将UL55扩增产物纯化后依次用EcoRⅠ、BamH I进行酶切，在T4 DNA 连接酶的作用下与使用相同内切酶处理的载体连接。得到的连接产物被转化到感受态的大肠埃希菌DH5α中，然后将已转化的DH5α菌接种到LB 固体培养基(含有卡那霉素)，37 ℃培养过夜。挑取单菌落克隆菌，采用PCR技术扩增克隆中的插入片段，经琼脂糖凝胶电泳筛选出含有UL55特异性序列的阳性克隆。将阳性克隆菌接种到LB液体培养基(含有卡那霉素)，37 ℃培养过夜后，提取质粒。质粒测序后验证克隆菌中插入序列的正确性。

表1 引物及序列Table 1 Primer and sequences

1.2.2 应用酵母双杂交筛选人胎脑cDNA文库中与HCMV UL55基因编码蛋白相互结合的蛋白 ①提取以pACT2(含转录激活域)为载体的人胎脑cDNA文库质粒。②实验中酵母双杂交筛选严格按照操作说明书进行。将重组质粒pGBKT7-UL55用醋酸锂(LiAc)法转化到酵母细胞AH109中，把提取的cDNA文库质粒转化到含有pGBKT7-UL55的AH109酵母细胞中，把转化后的菌液涂布到亮氨酸/色氨酸缺陷(-Leu/-Trp)的二缺平板和腺嘌呤/组氨酸/亮氨酸/色氨酸缺陷(-Ade/-His/-Leu/-Trp)的四缺平板，置于30 ℃培养箱内。挑取生长良好的克隆进行酵母菌增殖。③进行显色反应，30 ℃温箱孵育8 h，用玻璃珠法将酵母菌中显蓝色的克隆提取酵母质粒，应用电穿孔的转化方法(电压2.5 kV，电阻200 Ω，电脉冲25 μF)转化质粒到TG1大肠埃希菌中，在平板中(氨卞青霉素抗性)筛选人胎脑文库克隆。④将提取的大肠埃希菌中的文库质粒回转到含重组质粒pGBKT7-UL55的酵母菌中，把转化后的菌液涂布到四缺缺陷培养基上，于30 ℃培养箱内观察其生长情况。选取可在缺陷培养基中生长良好的菌落，增殖阳性菌并提取质粒。采用DNA测序方法检测与pGBKT7-UL55相互结合的人胎脑cDNA 文库基因序列。应用程序BLAST和数据库GenBank分析筛选出序列对应的蛋白质种类。

1.2.3 构建重组质粒pGEX-烯醇化酶1(enolase1, ENO 1) 应用Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System (Promega, USA)提取pACT2-ENO 1质粒，利用EcoRⅠ和XhoⅠ (Takara Bio, Inc., Dalian, China)两种限制性内切酶酶切文库质粒，在T4 DNA 连接酶的作用下将纯化的ENO 1编码序列与同时进行双酶切的含有GST标签的pGEX-4T-2载体 (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ, USA) 连接，并转化连接产物到感受态大肠埃希菌BL21中。并将转化后的大肠埃希菌BL21接种到LB 固体培养基上，该培养基含有氨苄霉素，置于37 ℃温箱内。第2天随机挑取阳性克隆，将菌落中质粒的插入片段进行PCR扩增，电泳后筛选出阳性结果。并将阳性克隆接种到含氨苄霉素的LB液体培养基中，过夜后提取菌液质粒，测序验证克隆结果。构建的ENO 1融合蛋白表达质粒命名为pGEX-4T-ENO 1。

1.2.4 GST-ENO 1融合蛋白的诱导表达 将构建的重组质粒pGEX-4T-2-ENO 1转化大肠埃希菌BL21(DE3)菌株，挑取单个克隆到装有10 mL LB(含100 μg/mL Amp)的50 mL BD管中，37 ℃、225 r/min 振荡培养至OD600值为1.0～1.5，加入IPTG(终浓度1 mmol/L)，25 ℃培养3 h，6 000 r/min离心10 min，4 ℃离心收集细菌，弃上清，将菌体沉淀于-20 ℃保存。

1.2.5 GST pull-down 实验 利用TNT体外转录翻译系统以pGBKT7-UL55重组质粒进行体外翻译表达pUL55蛋白，作为捕获蛋白；按照MagneGSTMPull-down System操作说明将提取的大pGEX-4T-ENO 1蛋白菌体裂解作为诱饵蛋白，室温下摇床孵育30 min, 捕获带有GST标签的蛋白及蛋白复合体。经3次洗脱后，20 μL MagneGSTTMBinding/Wash Buffer 重悬GST-ENO 1，加入TNT 体外表达的pGBKT7-UL55重组质粒 (80 μL)，MagneGSTTM Binding/Wash Buffer定量至800 μL，于4 ℃层析柜中孵育1.5 h，加入MagneGSTTM Binding/Wash Buffer洗涤3次。将上述样品加入含SDS 的上样缓冲液，100 ℃下处理5 min，13 000 r/min 离心2 min, 采用GST抗体进行Western blot分析回收样本中的蛋白复合物，ECL化学发光法鉴定结果并分析。

2 结果与分析

2.1 重组质粒pGBKT7-UL55的构建及鉴定

把HCMV UL55基因片段应用特异性引物进行扩增，扩增长度为723 bp，并将扩增产物克隆到酵母表达载体pGBKT7上。之后采用pGBKT7质粒两端的上、下游通用引物对得到的pGBKT7-UL55克隆鉴定。扩增含pGBKT7-UL55质粒的阳性克隆(图1)，通过DNA测序分析证明插入序列及插入位置符合预期。

图1 PCR 扩增pGBKT7-UL55 重组 质粒的琼脂糖凝胶电泳图谱Fig.1 PCR amplification pGBKT7-UL55 recombinant plasmid by agarose gel electrophoresisM:DNA marker；1：pGBKT7-UL55

2.2 从文库中筛选出与质粒pGBKT7-UL55相互作用的蛋白

在色氨酸缺陷(SD/-Trp)的培养基上进行筛选，由于SD/-Trp的酵母细胞AH109株可被pGBKT7为表达载体的蛋白诱导产生Trp。结果表明，在SD/-Trp 的培养基上转化pGBKT7-UL55的AH109酵母细胞能够成功生长。在1∶10色氨酸缺陷(SD/-Trp)的培养基中观察有75个酵母菌生长，计算转化效率为6×103cfu/ng。 利用醋酸锂顺序转化法，在含有重组质粒pGBKT7-UL55的酵母菌AH109中成功转入人胎脑cDNA文库。把转化后的菌液涂布到亮氨酸/色氨酸缺陷的二缺平板和腺嘌呤/组氨酸/亮氨酸/色氨酸缺陷的四缺平板培养基中，置于30 ℃孵箱培养5 d，共计15个四种氨基酸缺陷的平板上有65个酵母菌落，随后进行多次筛选以避免文库信息丢失。

2.3 对阳性质粒的验证、鉴定和序列分析

通过显色反应，选取13个增殖获得的阳性克隆。将提取的酵母质粒转入大肠埃希菌TG1，扩增后得到片段大小不同的产物。用回转实验对得到的文库质粒进行验证后，挑选26个克隆。对这些克隆进行DNA测序，同源序列比对使用GenBank数据库的BLAST程序进行，最后获得13个与HCMV UL55基因编码蛋白有结合的多肽序列,共筛选出10种与HCMV UL55相互作用蛋白。

2.4 回转实验验证结果

筛选后文库质粒再次回转到含有pGBKT7-UL55基因的酵母菌中，涂布于四缺培养基平板进行检测，重复筛选后，挑取序列结果一致的阳性克隆，进行DNA测序，应用软件分析后，有10种蛋白的编码序列与筛选获得序列的同源性在90%以上(表2)。

表2 酵母双杂交筛选阳性克隆与GenBank同源比对结果Table 2 Positive clones with GenBank homology alignment results by yeast two-hybrid screening

2.5 pGEX-4T-2-ENO 1 的构建与鉴定

利用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切文库质粒pACT2-ENO 1和pGEX-4T-2载体，经T4 DNA ligase过夜连接后纯化，将连接纯化产物转入感受态BL21细胞，得到pGEX-4T-ENO 1，琼脂糖凝胶电泳分析结果见图2。

图2 pGEX-4T-ENO 1重组质粒PCR鉴定Fig.2 The recombinant plasmid of pGEX-4T-ENO 1 identified by PCR

M:DNA marker;1～6：阴性结果；7：阳性条带为成功构建pGEX-4T-2-ENO 1

M:DNA marker;1-6:Negative results;7:pGEX-4T-2-ENO 1

2.6 GST-ENO 1 与HCMV UL55编码蛋白相互结合的体外验证

用 GST pull-down 技术验证GST-ENO 1 与HCMV UL55编码蛋白的相互结合，融合蛋白GST-ENO 1 与MagneGSTTMParticles结合，再将pGBKT7-UL55与GST-ENO 1充分结合，用上样缓冲液将结合在MagneGSTTMParticles上的蛋白溶解，样品处理后进行SDS-PAGE，用GST抗体进行Western印迹检测，结果见图3。与酵母双杂交结果一致，GST-ENO 1 可以捕获pGBKT7-UL55, 两者在体外存在直接的相互结合能力。

图3 GST-ENO 1与HCMV UL55相互作用Fig.3 GST-ENO 1 interaction with HCMV UL55A：所用一抗为抗GST；B：所用一抗为抗c-Myc；1：pGBKT7 UL55；2：GST pulldown回收蛋白，3：GST-ENO 1A：GST-ENO l detected with a mouse anti-GST monoclonal antibody; B: GST-ENO l detected with a mouse anti-c-Myc monoclonal antibody; 1: the UL55 protein alone;2: GST-ENO l and pGBKT7 UL55 captured by MagneGSTTM particles;3: GST-ENO l expressed in transformed BL21

3 讨 论

HCMV重要的包膜糖蛋白——gB蛋白, 由HCMV UL55编码，属于I型膜蛋白。病毒的复制周期可分为即刻早期、早期和晚期三个阶段。gB蛋白属晚期蛋白[6]。成熟gB由907个氨基酸的蛋白前体经糖基化加上N-及O-连接糖链后，最后在461 aa裂解为以二硫键相连的gp55和gpll6而形成，组成病毒包膜成分或被运送至感染细胞表面[4]。近年的研究认为HCMV主要包膜糖蛋白gB在病毒的感染和诱导机体产生免疫反应中发挥重要作用，并参与病毒穿入宿主细胞以及细胞间传播和感染细胞间融合过程，也是诱导机体产生免疫应答的主要靶位[7]。

近年来有国外学者分别对UL50、UL77和UL93编码蛋白的结合蛋白进行了报道[8-10]，国内学者对UL/b′区的UL135、UL136、UL141和UL142进行了研究[11-14]，但尚无HCMV UL55编码蛋白相关结合蛋白的研究报道。本研究采用酵母双杂交技术对人胎脑cDNA文库进行筛选，最终筛选到10种与gB蛋白相互结合的蛋白。但这些结合蛋白中只有编码烯醇化酶1(enolase1, ENO 1) 的基因序列是其完整的开放阅读框(Open Reading Frame, ORF) ， 更能证实筛选出的蛋白通过与UL55编码蛋白相互作用而影响HCMV的致病性。因此选取了ENO 1，应用 GST pull-down 技术体外实验以进一步验证GST-ENO 1与HCMV UL55的相互结合。通过Western blot检测，首先应用抗GST抗体，显示UL55编码蛋白与ENO 1 pulldown回收蛋白具有直接相互作用；然后又应用抗MYC抗体，再次验证了UL55编码蛋白与ENO 1 pulldown回收蛋白间的直接相互作用，这些实验结果进一步证实UL55编码蛋白与ENO 1的相互作用。

烯醇化酶是糖酵解过程中的重要酶类之一，能催化2-磷酸甘油酸(2-PGE)与磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)之间的相互转化[15]。在脊椎动物中ENO分为ENO 1 (α-ENO)、ENO 2 (γ-EN0)和ENO 3 (β-ENO)三种亚型，各亚型间存在高度的序列相似性和近似的酶动力学特性。有研究证实，ENO 1可催化PGA与PEP之间的转化，并可通过糖酵解途径参与心脏功能的调节。近年来研究表明，ENO 1在纤溶酶原激活和纤溶酶活性、细胞凋亡、肌生成和肌肉再生和肿瘤发生发展等许多生物学过程中发挥调控作用[16]。ENO 1作为纤溶酶原受体，通过介导纤溶酶活性调控细胞浸润、参与伤口愈合，以及组织重朔、胚胎发育和体内细胞迁移等过程[17]。

本研究通过酵母双杂交系统筛选出人胎脑cDNA文库中与UL55蛋白结合的宿主蛋白，同时应用 GST pull-down 技术进一步证实了ENO 1与HCMV UL55蛋白的相互作用。推测在HCMV侵入人体后，gB蛋白与ENO 1结合可能激活细胞纤溶系统以改变细胞活性和通透性，参与穿入细胞和细胞间的播散的过程；gB蛋白也可能通过与ENO 1结合提高病毒的穿透力及加强感染细胞间的传播，gB蛋白是参与病毒感染的关键蛋白。同时gB蛋白在HCMV感染过程中起到的作用也可能是与多种类基因共同参与作用的结果，这些基因共同作用的机制也是我们要深入进行的功能性研究。

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Screening and Identification of Proteins Interacted with UL55 Protein

JI Yao-hua, LIU Chang, QI Ying, MA Yan-ping, HUANG Yu-jing, LIU Zhong-yang, RUAN Qiang

(VirusLaboratory，ShengjingHospital，ChinaMedicalUniversity，Shenyang110004)

The objective of this study was to screen the binding proteins of human cytomegalovirus (HCMV) UL55 protein (pUL55) from an human fetus brain cDNA library and identify the binding ability between protein ENO 1 and HCMV pUL55 in vitro. Coding region of HCMV UL55 gene was cloned into the pGBKT7 vector. GAL4 yeast two-hybrid was used to screen the binding proteins of pUL55 from the human fetal brain cDNA library. After confirming the UL55 coding sequence have no the self-activaty, Yeast two hybrid rotary experiment was used to validate the reliability of interactions. Binding proteins were searched by the Blast network service at the National Center for Biotechnology Information using the sequences of the selected clones. The putative binding protein of pUL55, ENO 1, expressed by recombinant pGEX-4T-2 vector was further identified by GST pull-down technology.Ten proteins were identified to bind pUL55 from the human fetal brain cDNA library by yeast two-hybrid assay. The direct interaction between ENO 1 and pUL55 protein in vitro was confirmed by GST pull-down technology. At least 10 host proteins showed binding abilities to pUL55. Among them, the direct interaction between ENO 1 and pUL55 was demonstrated by GST pull-down experiments. The results provide new clues for further study on biological functions of UL55 protein.

Human cytomegalovirus；UL55-encoded protein；human fetal brain cDNA library；ENO 1；Interaction

辽宁省自然科学基金项目(201202283)

吉耀华 男，高级实验师。主要研究方向为医学病毒学。E-mail: jiyh@sj-hospital.org

* 通讯作者。男，教授，博士生导师。主要研究方向为医学病毒学。E-mail: ruanq@sj-hospital.org

2016-05-31；

2016-07-15

Q78

A

1005-7021(2016)05-0068-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.05.012