姚 慧，刘小花，陈心悦，封士兰

(1. 兰州大学 药学院,甘肃 兰州 730000; 2. 青海油田职工总医院,甘肃 敦煌 736202)



研究报告(204～208)

UPLC-ESI-MS法测定贞芪扶正胶囊中毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、红景天苷和黄芪甲苷的含量

姚 慧1,2，刘小花1，陈心悦1，封士兰1

(1. 兰州大学 药学院,甘肃 兰州 730000; 2. 青海油田职工总医院,甘肃 敦煌 736202)

建立了超高效液相色谱-电喷雾串联三重四级杆质谱法(UPLC-ESI-MS)同时测定贞芪扶正胶囊中红景天苷、毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷和黄芪甲苷含量的方法. 采用UPLC-ESI-MS联用法，乙腈和0.3%甲酸水溶液不同比例梯度洗脱，流速0.3 mL/min， 12 min内可完成测试，且线性关系良好(r2>0.999). 方法简便、准确、可靠、重复性好，可用于贞芪扶正制剂的质量控制.

贞芪扶正胶囊；超高效液相色谱-电喷雾串联三重四级杆质谱法；红景天苷；毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷；黄芪甲苷

贞芪扶正胶囊(ZFC)是由黄芪和女贞子两味药材组成的中药复方制剂. 在临床中常用来提高机体免疫力，促进正常功能的恢复或作为手术辅助的药物. 此外，它是目前临床使用的一线辅助治疗癌症的药物[1-12]. 更重要的是，中药辅助疗法正越来越多地被西方所接受. 欧洲最近的一项调查表明，欧洲已将中草药作为最常见的辅助药物应用于癌症患者的治疗[13]. 因此，为了确保贞芪扶正胶囊的临床疗效和安全性，探索控制其质量的研究是非常有意义的.

贞芪扶正胶囊中的黄芪和女贞子含有许多成分，主要成分为黄酮类、三萜皂苷及其醇苷类等[14-18]. 只用一、两种指标成分控制该制剂的质量，对于全面控制中药复方制剂的质量是不够的[17]. 因此，同时测定黄酮类、醇苷类和三萜皂苷对于较全面评价ZFC的质量将是一个很好的策略. 超高效液相色谱-电喷雾串联三重四级杆质谱法(UPLC-ESI-MS)已经成功地应用于中药质量评价中[18-20]. 本团队曾经建立了HPLC-DAD-ELAD法同时测定ZFC中6种生物活性成分的含量[16]，但分析时间为70 min，分析时间太长. 因此，我们有必要建立一个快速和有效的方法来更好地控制ZFC的质量.

本文收集10批贞芪扶正胶囊，乙醇回流法处理样品，采用UPLC/ESI/MS法分析，单次进样在12 min内同时测定贞芪扶正胶囊中3个不同类别的3种化合物的含量. 本文建立的样品处理过程和测定方法简单，为多指标控制贞芪扶正胶囊的质量提供了一种快速简便的方法.

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱仪(Waters ACQUITYTM UPLC- QUATI'RO Premier XE)，配有电喷雾离子源(ESI)； BS224S 型电子分析天平(十万分之一，德国Sartorius 赛多利斯).

10批贞芪扶正胶囊来自于不同生产厂家. 对照品：毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷(批号为201520)、黄芪甲苷(批号为201501)、红景天苷(批号为201508)和橙皮苷(批号为150721)，购自中国食品药品检定研究院. 各对照品纯度大于98%.

乙腈(德国默克)为色谱纯,水为超纯水. 甲醇和乙醇均为分析纯.

1.2 色谱与质谱条件

色谱柱：Fluoro-Phenyl色谱柱(2.1 mm×50 mm, 1.7 μm)；流动相为乙腈和0.3%甲酸水溶液，梯度洗脱，洗脱程序如表1所列；进样量：4 μL. 优选的质谱条件：采用正离子模式，离子喷雾电压为4 000 V，离子源温度300 ℃，对于毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、黄芪甲苷、红景天苷和内标橙皮苷的离子对分别为： m/z 447.21→m/z 285.3、m/z 807.4→m/z 202.94， m/z 323.14→m/z 121和m/z 633.18→m/z 331.18，锥孔电压分别为：25、90、35和55 V，碰撞电压分别为：20、50、30和32 eV.

表1 梯度洗脱条件

Table 1 Condition of gradient elution

t/min流速/(mL/min)A/乙腈B/0.3%甲酸03.06.06.1120.30.30.30.30.320406420208060368080

1.3 样品溶液制备

精密称取贞芪扶正胶囊2 g，用8倍量的95%乙醇回流提取，提取3次，每次1 h，合并提取液，将提取液减压蒸干，加甲醇溶解转移至10 mL量瓶中，并定容至刻度，摇匀，即得供试品溶液. 用微孔滤膜(0.22 μm)过滤后待测.

1.4 标准溶液制备

精密称取毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、红景天苷和黄芪甲苷，分别加入甲醇制成质量浓度为0.480、0.528和0.142 mg/mL的储备液，备用. 精密称取橙皮苷对照品用甲醇配置成质量浓度为0.295 mg/mL的储备液.

2 结果

2.1 线性关系

分别取毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、红景天苷和黄芪甲苷标准储备液，用甲醇逐级稀释成一系列不同质量浓度的对照品溶液，进样4 μL测定. 以进样量(X)为横坐标，与内标峰面积比值(Y)为纵坐标进行线性回归，各回归方程呈良好的线性关系. 结果如表2所列.

2.2 稳定性考察

同一样品分别在0、2、4、6、12和24 h进样4 μL，记录峰面积，各化合物的稳定性考察结果如表3所列.

2.3 精密度试验

取样品溶液测定日内精密度和日间精密度. 同一样品一天连续进样6次，计算日内精密度；同一样品连续3天每天进样2次，计算日间精密度. 各化合物日内精密度和日间精密度结果如表3所列.

表2 对照品的回归方程

Table 2 Regression equations of reference substances

化合物回归方程r2线性范围/μg1Y=0.1669X+0.01170.99910.5280～2.64002Y=9.6341X+0.84460.99940.8050～16.10003Y=1.7625X-0.59310.99931.4200～4.2600

2.4 重复性试验

取贞芪扶正胶囊J20140901样品6份，精密称定，制备成供试品溶液，按样品测定方法测定. 测得各化合物的平均含量如表3所列.

表3 3个分析物的精密度和重复性试验结果

Table 3 Precision and repeatability of 3 analytes

分析物日内精密度(n=6)(mg/g)RSD(%)日间(n=3)(mg/g)RSD(%)重复性试验结果(mg/g)RSD(%)13.58391.343.59691.983.58342.3820.46190.910.46651.810.46392.8130.54511.960.53451.860.53942.66

2.5 准确度试验

以加样回收率考察准确度. 取已知含量的同一批贞芪扶正胶囊6份，每份1 g，精密称定，各加入适量的混合对照品溶液，按供试品溶液制备项下操作测定，计算3个成分的加样回收率,结果如表4所列.

表4 加样回收率试验结果 (n=5)

Table 4 Results of recovery test sample

成分样品质量/μg加入质量/μg测得质量/μg平均回收率/%RSD/%毛蕊异黄酮-7-O-β-D-0.23090.22540.4619102.431.83葡萄糖苷0.23090.22540.45480.23090.22540.46370.23090.22540.46510.23090.22540.46490.23090.22540.4672红景天苷1.79191.79523.583999.811.951.79191.79523.58891.79191.79523.57561.79191.79523.58371.79191.79523.58451.79191.79523.6687黄芪甲苷0.27260.25560.5355100.331.990.27260.25560.52890.27260.25560.52910.27260.25560.52490.27260.25560.53770.27260.25560.5244

2.6 样品测定

取10批贞芪扶正胶囊，按1.3项下规定制备样品溶液，精密吸取4 μL进样UPLC-MS仪进行分析，色谱图如图1所示，测定结果如表5所列.

表5 10批贞芪扶正胶囊中3种化合物的质量浓度Table 5 Contents of three compounds in ZFC of 10 batches (mg/g，n=3)

3 讨论

比较了用乙醇作为溶剂回流、超声和索氏等方法提取以及提取后再用正丁醇萃取共6种方法，发现回流提取时各成分峰面积较大，提取率高，且与《中国药典》方法相比，省去了氨试液洗涤和正丁醇萃取等步骤，简化了样品处理方法，操作简便.

在贞芪扶正制剂中黄芪为君药，主要成分为黄酮和皂苷类化合物，女贞子的含量测定指标成分主要为红景天苷. 红景天苷和黄酮类成分有较强的紫外吸收，但皂苷类化合物没有紫外吸收或只在200 nm处有微弱的吸收，要同时测定这3类化合物必须将紫外检测器和蒸发光散射检测器结合起来，但是蒸发光散射检测器灵敏度较低. 因此本文采用UPLC-ESI-MS法同时测定贞芪扶正制剂中红景天苷、毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷和黄芪甲苷含量的方法，仅需12 min，耗时短，方法灵敏，重复性好，为多指标控制贞芪扶正制剂的质量提供了试验基础.

对于质谱条件的选择，分别采用正离子和负离子模式，最终发现正离子模式峰的响应好，因此采用正离子模式. 对离子喷雾电压和离子源温度进行优选，分别为4 000 V和300 ℃. 碰撞电压和锥孔电压分别从10～95 V和10～90 eV中进行选择，最终确定毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、黄芪甲苷、红景天苷和内标橙皮苷的锥孔电压分别为：25、90、35和55 V，碰撞电压分别为：20、50、30和32 eV.

红景天苷定性鉴别的离子对是m/z 323.14→m/z 121和m/z 323.14→m/z 145，定量测定选用离子对m/z 323.14→m/z 121. 毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷定性鉴别的离子对是m/z 447.21→m/z 285.3和m/z 447.21→m/z 270.2，定量测定选用离子对m/z 447.21→m/z 285.3. 黄芪甲苷定性鉴别的离子对是m/z 807.4→m/z 627.5和m/z 807.4→m/z 202.94，定量测定选用离子对m/z 807.4→m/z 627.5. 内标橙皮苷定性鉴别的离子对是m/z 633.18→m/z 331.18和m/z 633.18→m/z 483.26，定量测定选用离子对m/z 633.18→m/z 331.18. 用于定量测定的离子对具有较高响应.

4 结论

10批贞芪扶正胶囊红景天苷的质量分数范围为0.931 3～3.583 9 mg/g，毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷的质量分数范围为0.461 9～0.767 7 mg/g，黄芪甲苷的质量分数范围为0.467 2～0.581 0 mg/g. 该方法为贞芪扶正胶囊提高标准提供了依据.

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UPLC-ESI-MS Method for Rapid Quantification of Rhodioside，Calycosin-7-O-β-D-Glucosideand Astragaloside IV in Zhenqi Fuzheng Capsule

YAO Hui1,2, LIU Xiao-hua1, CHEN Xin-yue1, FENG Shi-lan1

(1.SchoolofPharmaceutical,LanzhouUniversity,Lanzhou730000,China;2.GeneralHospitalofWorkersinOilFieldofQinghai,Dunhuang736202,GansuChina)

The quantitative method of isoflavonids, phenylpropanoids and saponin in Zhenqi Fuzheng capsule was established using the ultra-pressure liquid chromatography with tandem mass spectrometry (UPLC-ESI-MS) method. ACN and 0.3% formic acid water were used as the mobile phase by gradient elution, with a detection time of 12 min, and a good linear correlation ofr2>0.999. It was proved that the method is simple, accurate, reliability with good repeatability that can be used as quality control for Zhenqi Fuzheng capsule.

Zhenqi Fuzheng capsule；UPLC-ESI-MS；calycosin-7-O-β-D-glucoside; rhodioside; astragaloside IV

2016-09-02;

2016-10-25.

中央高校基本科研业务费专项资金(No. lzujbky-2015-59)，甘肃省中药质量与标准研究重点实验室培育基地(ZYZL16-007)

姚慧(1987-)，硕士研究生，主要研究方向为中药制剂分析，Tel:0931-8915685，E-mail：liuxiaoh@lzu.edu.cn

封士兰，教授，博导，《分析测试技术与仪器》第七届编委，主要研究方向为中药中化学成分分离分析，Tel：0931-8915686，E-mail：fengshl@Lzu.edu.cn.

O657.3

A

1006-3757(2016)04-0204-05

10.16495/j.1006-3757.2016.04.002