赵 清

(河南大学附属淮河医院,开封475000)



miRNA-21-5p调节IL-1β诱导大鼠滑膜细胞凋亡作用机制研究

赵 清

(河南大学附属淮河医院,开封475000)

目的：探讨miRNA-21-5p在由IL-1β所诱导的大鼠滑膜细胞凋亡中的作用机制。方法：将大鼠滑膜细胞进行体外培养，采用甲苯胺蓝染色法对Ⅱ型胶原及蛋白多糖进行鉴定；将滑膜细胞分为正常对照组(NC组)，对照组(Control组)，空白质粒转染组(BL组)以及转染组(miRNA组)4组。Control、BL和miRNA 3组细胞均经IL-1β诱导处理后采用MTT检测细胞增殖率，同时采用RT-PCR和Westem blot检测Bax和Bcl-2表达。结果：所有细胞均能分泌蛋白多糖和Ⅱ型胶原。MTT检测发现，经IL-1β处理后，miRNA组细胞增殖率显著低于Control组[(31.6±2.9)%vs(54.7±3.5)%]，差异具有统计学意义(P<0.05)；与Control组相比，miRNA组Bax mRNA及蛋白表达水平显著增高(1.00±0.31 vs 0.75±0.15，P<0.05)，miRNA组Bcl-2 mRNA及蛋白表达水平显著降低(2.24±1.02 vs 1.00±0.64，P<0.05)。结论：miRNA-21-5p可通过促进Bax以及抑制Bcl-2表达，对由IL-1β所诱导的滑膜细胞异常增生起到保护的作用，为治疗类风湿性关节炎提供了新的思路。

类风湿性关节炎；miRNA-21-5p；Bax；Bcl-2

类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种自身免疫系统发生功能障碍而导致的疾患，由于大量炎症因子以及滑膜细胞发生过度的增殖而对关节软骨造成破坏[1]。白介素-6(Interleukin-6,IL-6)在RA病理发生过程中起重要作用并可促进滑膜细胞的增殖，故此，如何有效地抑制滑膜细胞的异常增殖，成为控制和治疗RA病情的关键点[2，3]。体外细胞研究中，常通过IL-6诱导滑膜细胞模拟RA病理过程。miRNA是一类微小RNA，大量的基础研究证实，miRNA对肿瘤细胞具有一定的调节作用[4-7]。相关研究表明，miRNA-21-5p的过表达对肿瘤的增殖具有抑制效果，但是miRNA-21-5p在RA中的作用机制研究相对有限，本次研究针对miRNA-21-5p对IL-1β所诱导的滑膜细胞发生增殖的作用进行研究探讨。

1 材料与方法

1.1 材料 SPF级别Wistar雄性大鼠购自南京医科大学动物中心，脂质体2000(Invitrogen公司，美国)，四甲基偶氮唑蓝(MTT)(Sigma 公司，美国)；Bcl-2、Bax以及GAPDH抗体购自美国Snat Cruze 公司；引物序列由南京金斯瑞生物科技公司合成。

1.2 方法

1.2.1 分离与培养大鼠关节滑膜细胞 取5只SPF级别Wistar雄性大鼠，乙醚麻醉后处死，将软骨片削取后，剪碎用PBS清洗，800 r/min离心5 min，弃除上清液后，将含有5%FBS的浓度为0.04%的Ⅱ型胶原酶加入，37℃水浴过夜，以200目的筛网过滤后，800 r/min离心5 min，再次弃除上清液，然后加入含有10%FBS的DMEM培养基中培养，温度控制在37℃，在CO2浓度为5%的培养箱中培养，72 h更换培养液。细胞第3代进行所有检测。

1.2.2 表型鉴定 PBS将爬片清洗2次后，4%的多聚甲醛，在室温下进行20 min固定后，对蛋白多糖和细胞Ⅱ型胶原表达进行检测。

1.2.3 细胞处理 将滑膜细胞分为4组：NC组、Control组、BL组以及miRNA组，其中BL组：使用脂质体2000作为载体将慢病毒转染入滑膜细胞中。miRNA组：使用脂质体2000作为载体将miRNA-21-5p转染入滑膜细胞中，根据数据库定义miRNA-21-5p转染质粒(http://www.mirbase.org/)。NC组和Control组均未进行转染。

将各组滑膜细胞分别接种在6孔板中直至80%～90%融合，用0.5%FBS培养基代替，使用浓度为10 ng/ml的IL-1β孵育1 h后进行检测。

1.2.4 MTT检测 按照四甲基偶氮唑蓝(MTT)试剂盒中说明书进行操作，测定细胞增殖率。

1.2.5 RT-PCR 采用RT-PCR对Bax和Bcl-2 mRNA表达水平进行检测，以β-actin作为内参使用。引物序列详见表1。

1.2.6 Western blot检测 根据Bcl-2、Bax以及GAPDH抗体说明书步骤对所有组细胞进行检测。

2 结果

2.1 滑膜细胞鉴定 通过免疫细胞化学染色发现所培养的细胞均能分泌Ⅱ型胶原(图1)，经甲苯胺蓝染色后细胞呈紫色(图2)。

2.2 miRNA-21-5p在各组中的表达水平 NC组和miRNA组细胞miRNA-21-5p表达水平与Control组相比显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；而BL组和Control组之间无明显差异(P>0.05)，见图3。

2.3 MTT检测 NC组和miRNA组细胞增殖率[(20.0±8.4)%和(31.6±2.9)%]与Control组(54.7±3.5)%相比显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；而BL组和Control组之间无明显差异(P>0.05)，见图4。

2.4 各组Bax和Bcl-2 mRNA和蛋白表达对比 与Control组相比，miRNA组Bax mRNA及蛋白表达水平显著增高(1.00±0.31 vs 0.75±0.15，P<0.05)，miRNA组Bcl-2 mRNA及蛋白表达水平显著降低(2.24±1.02 vs 1.00±0.64，P<0.05)见图5、6。

表1 RT-PCR引物序列

Tab.1 RT-PCR primer

GenePrimersequences(5′⁃3′)Bcl⁃2AGCGTCAACGGGAGATGTCGTGATGCAAGCTCCCACCAGBaxCAGCTCTGAGCAGATCATGAAGACAGCCCATCTTCTTCCAGATGGTGAGCβ⁃actinCGGGACCTGACCGACTACCTGGCCGTGATCTCCTTCTGC

图1 Ⅱ型胶原Fig.1 Type II collagen

图2 蛋白多糖Fig.2 Protein polysaccharide

图3 各组miRNA-21-5p mRNA表达对比(倍)Fig.3 miRNA-21-5p gene expression of four groups (Fold)Note: *.P<0.05.

图4 滑膜细胞增殖率对比±s，%)Fig.4 Comparison of proliferation rate of synovial Note: *.P<0.05.

图5 各组Bcl-2 mRNA和蛋白表达对比(倍)Fig.5 Gene and protein expressions of Bcl-2 in four groups(Fold)Note: *.P<0.05.

图6 各组Bax mRNA和蛋白表达对比(倍)Fig.6 Gene and protein expressions of Bax in four groups (Fold)Note: *.P<0.05.

3 讨论

炎性因子IL-1β通过对大鼠滑膜细胞进行诱导，使其可分泌出多种炎性介质，从而在体外建立起RA炎性细胞模型。本次研究从大鼠上分离培养原代滑膜细胞，对各组原代细胞采用IL-1β诱导的方法，研究miRNA-21-5p在整个RA发病过程中的作用机制。

目前为止大量的研究已经证实，miRNA-21-5p对调控恶性肿瘤细胞的增殖方面具有积极的意义[8-10]。RA是一种由于滑膜细胞发生异常增生从而对关节软骨造成破坏为主要的临床特征，并使滑膜细胞的信号传导发生异常的疾患[11]。因此，我们推测miRNA-21-5p过表达对RA可能存在一定的保护效果。IL-1β是一种多肽类的细胞因子，其在RA的病程中具有重要的作用[12]。在体外RA研究中IL-1β可作为一种稳定的诱导剂进行使用[13]。通过本次研究发现，经过miRNA-21-5p转染的miRNA组滑膜细胞的增殖率显著低于Control组和BL组，此结果表明过表达miRNA-21-5p可有效抑制IL-1β所诱导的滑膜细胞增殖。同时还发现，Control组与BL组之间无明显差异，此结果表明，在进行载体转染过程中对细胞造成的损伤较小。为进一步阐述miRNA-21-5p在整个过程中的作用机制，我们进一步对相关蛋白和mRNA表达进行检测。

Bcl-2和Bax与细胞凋亡增殖密切相关；若Bax表达增加时，则会形成与Bax相同源的二聚体，使细胞趋向于凋亡和抑制增殖；若Bcl-2表达过量时，则会与Bax一起形成一个异源二聚体，从而抑制凋亡促进增殖，所以当Bax表达增高，Bcl-2表达降低时，可以有效抑制细胞增殖[14，15]。在本次研究中发现，转染后的滑膜细胞在被IL-1β诱导后，与未转染miRNA-21-5p的滑膜细胞相比，其Bax mRNA和蛋白表达显著增高，而Bcl-2则显著降低，因此，推测可能是由于miRNA-21-5p的过表达，导致Bax表达增高，Bcl-2表达降低，进而使得滑膜细胞的增殖受到有效的抑制。

本次研究通过体外细胞实验证实，miRNA-21-5p表达在控制RA疾病的进程中起到了关键性的作用，RA病程的发展可能与miRNA-21-5p的低表达存在一定的相关性。因此，有效提高miRNA-21-5p的表达从而促使Bax表达增高，Bcl-2表达降低，可有效控制因RA所导致的滑膜细胞异常增生，为临床治疗RA以及研制RA药物提供了新的思路。

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[收稿2016-02-25 修回2016-03-22]

(编辑 张晓舟)

Mechanism of miRNA-21-5p on apoptosis of IL-1β-induced rat synovial cells

ZHAO Qing.

Affiliated Hospital of Henan University of Huaihe River，Kaifeng 475000,China

Objective:To investigate the role of miRNA-21-5p in the apoptosis of rat synovial cells induced by IL-1β.Methods: The synovial cells of rats were cultured in vitro and identification of type Ⅱ collagen and proteoglycan were stained by toluidine blue method;the synovial cells were divided into normal control group (NC group),control group (Control group),blank plasmid transfection group (BL group) and transfection group (miRNA group) four groups.Control,BL and miRNA three groups of cells were treated by IL-1β,the cell proliferation rate was detected by MTT,while RT-PCR and Westem blot were used to detect the expression of Bax and Bcl-2.Results: All cells were able to secrete protein polysaccharide and collagen type Ⅱ.MTT detection found that after IL-1β treatment,the cell proliferation rate of miRNA group was significantly lower than that of control group[(31.6±2.9)%vs(54.7±3.5)%],the difference was statistically significant (P<0.05);compared with the control group,Bax mRNA and protein expression levels of miRNA group were significantly lower(1.00±0.31 vs 0.75±0.15,P<0.05)，Bcl-2 mRNA and protein expression levels of miRNA group were significantly higher (2.24±1.02 vs 1.00±0.64,P<0.05).Conclusion: miRNA-21-5p can inhibit the expression of Bcl-2 and promote the expression of Bax,the protective effect of sliding mode cells induced by IL-1β.To provide a new way of thinking for the treatment of rheumatoid arthritis.

Rheumatoid arthritis;miRNA-21-5p;Bax;Bcl-2

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.11.008

赵 清(1974年-)，女，硕士，主要从事风湿免疫性疾病方面的研究。

R34

A

1000-484X(2016)11-1603-04