肖 靖，崔瑞琴，周小平*

(1.宁夏医科大学中医(回医)学院,银川 750004;2.宁夏医科大学中医(回医)学院 教育部生育力保持重点实验室,银川 750004)



开结汤对腺嘌呤所致慢性肾衰竭模型大鼠TGF-β1、MCP-1表达的影响

肖 靖1，崔瑞琴2，周小平1*

(1.宁夏医科大学中医(回医)学院,银川 750004;2.宁夏医科大学中医(回医)学院 教育部生育力保持重点实验室,银川 750004)

目的 研究开结汤对腺嘌呤所致慢性肾衰竭模型大鼠TGF-β1、MCP-1表达的影响。方法 选取60只SD大鼠按体质量随机分为6组:空白对照组、模型组、开结汤低、中、高剂量治疗组、尿毒清治疗组,除空白组外,其余5组连续灌服腺嘌呤21 d以复制慢性肾衰竭大鼠模型，剂量均是300 mg/(kg·d)。造模成功后用开结汤、尿毒清进行干预，治疗30 d后，心脏取血检测常规生化指标，取大鼠肾组织,用免疫组化方法检测TGF-β1、MCP-1的表达。结果 与正常组比较，模型组大鼠血清中BUN、Scr、P的含量及肾组织中TGF-β1、MCP-1的表达显著增高,差异有统计学意义(P<0.05)；经过药物治疗,开结汤3个剂量组及尿毒清组大鼠血清中BUN、Scr、P的含量及肾组织中TGF-β1、MCP-1的表达明显低于模型组(P<0.05)；开结汤3个剂量组与尿毒清组比较，低、中剂量组在降低血清BUN、Scr、P的含量及抑制TGF-β1、MCP-1在肾组织中表达方面较尿毒清组显著(P<0.05)。结论 开结汤可以改善肾功能，保护肾脏。作用途径是抑制TGF-β1及MCP-1在肾组织中的表达，减少炎性细胞浸润，从而延缓肾纤维化进程。

开结汤；慢性肾衰竭；TGF-β1；MCP-1.

慢性肾衰竭(CRF)是指各种肾脏疾病引起的缓慢进行性肾功能损害，最后导致尿毒症和肾功能完全丧失，引起一系列临床症状和生化、内分泌等代谢紊乱组成的临床综合征[1]。肾小球硬化、肾小管萎缩或者扩张变形、肾间质纤维化成为CRF主要的病理基础[2]，而多数研究者在治疗慢性肾衰竭时，更加注重于如何有效抑制肾脏纤维化的进程。有研究[3]报道,TGF-β1与MCP-1在促进肾脏病理改变，加重肾脏纤维化的过程中起到重要的作用。本课题研究通过复制CRP动物模型，应用《伤寒杂病论》中经方“桂枝茯苓枳实芍药甘草汤”加减,并重新命名为“开结汤”进行药物干预治疗，观察CRF大鼠肾组织中TGF-β1、MCP-1的表达情况，从而探讨开结汤抑制慢性肾衰竭时肾脏纤维化的可能机制。

1 材料与方法

1．1 动物 SD雄性大鼠60只，SPF级，体质量(250±30)g。由宁夏医科大学实验动物中心提供，合格证号:SCXK(宁)2011-0001。饲养温度：(26±1)℃，相对湿度：60%。

1．2 药物 开结汤组成：桂枝、茯苓、枳实、生白芍、炙甘草。由本校药学系中药制备教研室加工、浓缩成1 g/mL(每mL含1 g生药)，用时用蒸馏水配制成所需浓度。尿毒清颗粒：5g/袋，康臣药业(内蒙古)有限责任公司生产，批准文号：国药准字Z20073256。用时用蒸馏水配制。腺嘌呤(C5H5N5)，上海笛柏化学品技术有限公司生产，用时用生理盐水配成所需浓度的腺嘌呤混悬液。以上药物置于4 ℃冰箱备用。

1．3 试剂与仪器 TGF-β1试剂盒(北京博奥生物有限公司)；MCP-1试剂盒(北京博奥生物有限公司)；DAB显色液试剂(北京博奥森生物有限公司)；RM2015石蜡切片机(德国莱卡)；Eppendorf-5430离心机(德国)；DSHZ-300型恒温水浴箱(江苏太仓医用仪器厂)；Image-Pro Plus多功能真彩色细胞图像分析管理系统(美国Media Cybernetics 公司)；352型酶标仪(芬兰:Labsystems Multiskan MS)。

1．4 造模及分组 参照文献[4-5]方法造模:在预实验的基础上将60只SD大鼠适应性喂养3 d，按体质量随机分为6组：空白对照组、模型组、开结汤低、中、高剂量治疗组、尿毒清治疗组，每组各10只大鼠。除空白组外其他5组灌服300 mg/(kg·d)的腺嘌呤，正常组灌服蒸馏水(10 mL/kg)，连续灌胃21 d。造模期间大鼠自由进食、饮水。

1．5 给药方式 按照人与大鼠用药剂量折算得出大鼠灌胃剂量：开结汤低剂量组3．1 g/(kg·d)、中剂量组6．3 g/(kg·d)、高剂量组12．6 g/(kg·d)，尿毒清组2．63 g/(kg·d)，模型对照组与正常对照组按照10 mL/kg的剂量灌服蒸馏水，连续灌胃30 d，治疗期间大鼠自由进食、饮水。

1．6 观察指标 治疗结束后，用10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉大鼠，剖开大鼠胸腔，暴露心尖，用一次性真空采血管抽取心脏血(5 mL)，将收集到的心脏血高速离心分离出血清，用全自动生化分析仪检测Scr、BUN、P等指标；剖取双肾，观察肾脏大小、质地、颜色后迅速置于4%多聚甲醛液中固定，经脱水、透明、浸蜡、包埋、常规切片，按照TGF-β1、MCP-1试剂盒的操作步骤进行免疫组化实验。采用Image-Pro Plus 6．0 图像分析系统对各组标本予图像采集并处理分析，每张切片于高倍镜(×400)下随机选择10个视野，以棕黄色染色表达为阳性。

2 结果

2．1 血清生化指标检测结果 见表1。

表1 各组大鼠血清生化指标检测结果比较

注:与模型组比较，#P<0．05，##P<0．01；与尿毒清组比较，△P<0．05，△△P<0．01

2．2 TGF-β1免疫组化显色情况 正常组大鼠肾小管上皮细胞中有少量TGF-β1表达，着色较浅，髓质未见表达，无阳性着色；与正常对照组大鼠相比，模型组肾小管上皮细胞和髓质的TGF-β1蛋白表达量明显增加，呈极强阳性表达，着色极深；开结汤3个剂量组中，高剂量组大鼠肾小球、肾间质、肾小管着色较低、中剂量组变深；开结汤组与尿毒清组比较，低、中剂量组在抑制TGF-β1在肾组织中表达的效果优于尿毒清组。

2．3 MCP-1免疫组化显色情况 MCP-1在正常组肾小球、肾间质、肾小管有极少量表达，着色浅；模型组肾小球、肾间质、肾小管着色明显较正常组深；开结汤3个剂量及尿毒清组肾小球、肾间质、肾小管着色较模型组明显变浅，说明其表达量降低；开结汤3个剂量组与尿毒清组比较，低、中剂量组肾小球、肾小管、肾间质着色较浅，说明低、中剂量范围内的开结汤在降低肾组织中MCP-1的表达方面较尿毒清组显著。

2．4 各组大鼠肾组织TGF-β1及MCP-1 OD值比较 见表2。

组 别TGF-β1MCP-1正常组 0.10±0.21 0.15±0.21 开结汤低剂量组0.14±0.48#△▲0.32±1.62#△▲开结汤中剂量组0.12±0.28#△▲0.22±0.55#△▲开结汤高剂量组0.25±1.48#△ 0.49±2.30#△ 尿毒清治疗组 0.20±1.08#△ 0.34±1.18#△ 模型组 10.45±1.83## 0.52±6.19##

注:与正常组比较，#P<0．05，##P<0．01；与模型组比较，△P<0．05；与尿毒清组比较，▲P<0．05

3 小结

本课题应用腺嘌呤造成CRF模型，模型组大鼠肾组织中TGF-β1、MCP-1在肾小管及肾间质的表达较正常组显著；经过药物干预治疗，与模型组比较,开结汤3个剂量组与尿毒清治疗组血清Scr、BUN、P的含量均降低，说明药物治疗可以改善肾功能,免疫组化结果显示开结汤3个剂量组及尿毒清组大鼠肾组织中TGF-β1、MCP-1的表达较模型组降低；开结汤3个剂量组与尿毒清组比较，开结汤低、中剂量组在降低血清Scr、BUN、P的含量方面优于尿毒清组，且低、中剂量的开结汤通过抑制肾组织中TGF-β1、MCP-1的表达，从而抑制肾组织纤维化，延缓肾衰竭进程[6-12]。

开结汤中桂枝温阳发汗，还可散下焦蓄血[13]，药理研究[14]认为桂枝还具有抗血小板聚集和体内抗血栓的作用；芍药主入肝经,可降低血清中TGF-β1、玻璃酸、Ⅲ型前胶原和层黏蛋白的含量以及肝组织中羟脯氨酸含量，减轻肝损伤程度和胶原纤维增生程度[15]；枳实理气消滞，具有抗血小板聚集及抑制红细胞聚集的作用[16]；茯苓健脾利水；甘草调和诸药[17]。本方活血行气力强，能很好的抑制肾纤维化的发生，改善肾功能，同时不忘健脾利水，调理脏腑气机，纠正机体水液代谢紊乱,抑制炎症发生,减少TGF-β1、MCP-1等细胞因子的表达，提高肾功能，抑制肾衰竭的进一步发生。

综上所述，开结汤具有很好的抗纤维化作用，抑制炎性细胞浸润减少TGF-β1、MCP-1在肾组织中表达，延缓肾衰竭的进一步发展。

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Kaijie decocition on adenine induced chronic renal failure model in rats TGF-β1 and MCP-1 expression

XIAO Jing1,CUI Ruiqin2,ZHOU Xiaoping1*

(1.College of Traditional Chinese (hui) Medicine,Ningxia Medical University,Yinchuan 750004,China;2.College of Traditional Chinese (hui) Medicine,Ningxia Medical University/ Key Laboratory of Fertility Preservation and Maintenance of Ministry of Education,Yinchuan 750004,China)

Objective To study the effect of Kaijie decoction on adenine induced chronic renal failure model in rats TGF-β1 and MCP-1 expression.Methods The 60 rats were selected and divided randomly for 6 groups:control group,model,Kaijie decocition in the treatment of low dose treatment,medium dose treatment,high dose treatment and Niaoduqing group,in addition to the control group,the other 5 groups were treated with D/300mg/kg adenine for 21 days to make the model of CRF,after the success of the model were administered to Kaijie decocition and Niaoduqing for 30 days.After the treatment,routine biochemical indexes of cardiac blood sampling and the renal tissues were made pathological sections to study TGF-β1 and MCP-1 expression factors.Results Compared with the normal group,the content of BUN,Scr,P in serum and the expression of TGF-β1,MCP-1 in renal tissue were significantly higher than that in the model group,the difference was statistically significant (P<0.05);after drug treatment,Kaijie decocition three dose groups and Niaoduqing group serun levels of BUN,Scr,P and TGF-β1,MCP-1 in renal tissue were lower than the model group (P<0.05);compared with Naoduqing group,low and middle dose of Kaijie decocition in reducing the content of serum BUN,Scr,P and inhibition of the expression of TGF-β1,MCP-1 in renal tissue were more significantly than Naoduqing group.Conclusion Kaijie decocition through inhibition of the expression of TGF-β1 and MCP-1 in kidney tissue,delay the progression of renal fibrosis,inflammatory cell infiltration,improve renal function and renal protection.

Kaijie decoction;chronic renal failure;TGF-β1;MCP-1

10.13463/j.cnki.cczyy.2016.06.007

国家自然科学基金“补益营卫方对衰老表皮稳态性影响的机制研究”(81460729)。

肖 靖(1990-)，女，硕士研究生，主要从事中医药治疗肾脏疾病的研究。

R285.5

A

2095-6258(2016)06-1119-04

2016-06-07)

*通信作者：周小平，电话-13896563103，电子信箱-191008380@qq.com